氨基酸紙層析
一、原理：氨基酸混合液經(jīng)紙上層析，由于不同的氨基酸有不同的分配系數(shù)，移動(dòng)速率不同，從而達(dá)到分離。經(jīng)顯色后，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜比較或與氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)Rf值比較，可辨別各種氨基酸。
二、材料與試劑
1、酸向展開劑：正丁醇：88%甲酸：水=15：3：2，量取正丁醇150ml，88%甲酸30ml，蒸餾水20ml，置入分液漏斗中充分振蕩。此液需新配制。
2、12%氨水：量取60ml濃氨水，加入70ml蒸餾水稀釋。
3、堿向展開劑：正丁醇：12%氨水=13：3，量取130ml正丁醇，30ml12%氨水，置于分液漏斗中充分振蕩。
4、0.2%茚三酮顯色液：稱取0.2g茚三酮，溶于100ml丙酮中。
5、0.5%標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：稱取各種氨基酸各0.5g，分別置于100ml容量瓶中，用10%異丙酮溶液溶解，定容至刻度。
6、微量注射器、層析缸、新華濾紙、噴霧器、氨基酸混合液(可任選2-3種)
表2-4 各種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)Rf值
| 氨基酸 | 標(biāo)準(zhǔn)Rf值 | 氨基酸 | 標(biāo)準(zhǔn)Rf值 | ||
| 第一相（酸向） | 第二相（堿相） | 第一相（酸向） | 第二相（堿相） | ||
| 天門冬氨酸 谷氨酸 賴氨酸 精氨酸 組氨酸 甘氨酸 羥丁氨酸 r－氨基丁酸 丙氨酸 酪氨酸 | 0.27 0.35 0.12 0.15 0.11 0.30 0.37 0.46 0.47 0.25 | 0.01 0.01 0.03 0.05 0.10 0.06 0.10 0.08 0.14 0.23 | 蛋氨酸 頡氨酸 色氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 胱氨酸 絲氨酸 脯氨酸 | 0.64 0.67 0.64 0.77 0.79 0.73 0.08 0.28 0.48 | 0.31 0.32 0.48 0.52 0.57 0.58 0.02 0.06 0.16 |
三、操作
1、層析濾紙的準(zhǔn)備：取兩張19cm×23cm的新華濾紙一號(hào)，在右下角距二底邊各2cm交點(diǎn)處用鉛筆畫一原點(diǎn)，同時(shí)畫出二邊的原線。
2、點(diǎn)樣：將10ul樣品液點(diǎn)于一張濾紙?jiān)c(diǎn)上，用微量注射器分多次點(diǎn)完。點(diǎn)一次后，吹干再點(diǎn)第二次。點(diǎn)的直徑應(yīng)小于0.5cm。
3、展開：將點(diǎn)樣后的兩張濾紙?jiān)谙嗤牟僮鳁l件下用上行法進(jìn)行雙向展開。
(1)第一向(酸相)展開：以濾紙19cm長的一邊為高，用線縫成圓筒形(注意紙的兩邊不相碰)，放在盛有酸相展開劑的層析缸內(nèi)飽和1h。然后將點(diǎn)樣端放入展開劑中，待溶液前沿上升至離頂端1cm左右時(shí)取出，吹干至無正丁醇?xì)馕稙橹埂?/span>
(2)第二向(堿相)展開：把濾紙轉(zhuǎn)900，以23cm長的一邊為高，用線縫成圓筒形(注意紙的兩邊不相碰)，放在盛有堿相展開劑的層析缸內(nèi)飽和1h。然后將點(diǎn)樣端放入展開劑中，待溶液前沿上升至離頂端1cm左右時(shí)取出，吹干。然后以同樣條件，再在堿相展開劑中展開一次，取出吹干。
4、顯色：展開結(jié)束后，濾紙用0.2%茚三酮溶液噴霧顯色，65℃烘干。
四、定性鑒定：用樣品的層析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜的層析圖譜相比較，根據(jù)Rf值的大小，確定樣品中氨基酸的種類。
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