Transwell侵襲實驗總結之操作步驟

一、Transwell小室制備

1. 無基質膠Transwell小室制備

① 包被基底膜：
用50 mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200 ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5 mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培養板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma戰友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。

2. 有基質膠的Transwell小室制備
Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養板中，在上室加入300 μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置15－30 min，使基質膠再水化。再吸去剩余培養液。

二、制備細胞懸液

① 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24 h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
② 消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至1-10×105，個人認為不要超過5×105。具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。

個人經驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數法統計結果的話將難以計數；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。個人認為，對照組和處理盡量不要分開計數，因為細胞數目的差異會嚴重影響實驗結果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數，那么計數一定要多重復幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。

三、接種細胞

① 取細胞懸液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200 μl。
② 24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趨化因子的培養基，不同的培養板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。
③ 培養細胞：常規培養12－48 h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

以我的課題為例，我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力，還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72 h的IC50。用這個濃度處理細胞，24 h內對細胞增殖并無明顯抑制，但24 h后，抑制作用就開始出現了。所以，用這個濃度來做Transwell，處理時間也必須限定在24 h內，否則一旦藥物抑制了細胞增殖或者誘導出凋亡，使處理組細胞數目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細胞數目本身就比對照組少而引起的了。
時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內會有一定量的MMPs儲存，短時間內可能侵襲能力不會有太大改變。同時從藥物被吸收進去，進而發揮作用，影響MMPs表達，到最后釋放到培養基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應，但前提是這個時間范圍內細胞數目不能有明顯變化。另外，我看到細胞在小室內的形態不是正常培養貼壁的形態，而是圓形的，仍是懸浮時的形態，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正常現象
在培養過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產生，這是正常現象，可不予處理，但我遇到過培養一段時間后，膜下出現了大氣泡，幸虧及時發現，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后1－2 h把培養板從培養箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產生。

四、結果統計

檢測穿過的細胞數有兩種方法：

1. 直接計數法
（1）“貼壁”細胞計數

這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去。
通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞

① 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞

② 染色：常用的染色方法有結晶紫染色、臺盼藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個人推薦采用0.1%結晶紫染色，這種方法有如下優勢：

(1). 不需要固定細胞，直接染色即可。

(2). 配制簡單方便。

(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570 nm 測其OD值，間接反映細胞數。個人認為這是結晶紫染色最大的優勢所在。因為，雖然經過準確的細胞計數，往往穿過膜的細胞數仍難以準確控制，可能某一批實驗穿過的細胞會特別多，以致細胞成堆，這種情況下就難以計數了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標儀檢測。使用結晶紫染色要注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。

③ 細胞計數：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側附著的細胞。也有不少人用手術刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。
取若干個視野計數細胞個數。論壇里一般采用3－5個視野，也有人用10個，都是隨機選取，個人認為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響，特別是計數視野較少的時候。我選取16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。不同廠家不同型號的小室，膜的面積不盡相同，但個人認為，拍照時還是應當選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。

（2）“非貼壁”細胞計數

由于某些細胞自身的原因或某些膜的關系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。這種情況我沒有遇到過，根據論壇里提供的經驗，可以收集下層培養液，用流式細胞儀計數細胞量，也可用細胞計數的方法直接在鏡下計數，個人認為MTT應該也是可以用的，有興趣的可以試試看。

2. 間接計數法

間接計數法主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數獲得準確的細胞數所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。

（1）MTT法

① 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞
② 24孔板中加入500 μl含0.5 mg/ml MTT的完全培養基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養基中，37 ℃ 4 h后取出。
③ 24孔板中加入500 μl DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10 min，使充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測OD值。

（2）熒光試劑檢測
這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。Chemicon的ECM554即屬于這類。

（3）結晶紫檢測
上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結晶紫染色還有個優點，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色

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