Ficoll密度梯度離心法
測定細胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞等。取得有活性的細胞應根據不同目的，采用不同方法，考慮：
(1)細胞純度；
(2)細胞獲得量；
(3)細胞活力；
(4)使用方法的簡易程度和本室條件等。
目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。
(一) 原理:
常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是 1.077±0.001 的 聚 蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，犌W水性高，平均分子量為400,000，當密度為1.2g／ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
(二) 方法:
1. 在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2. 取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鐘。
3. 離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶(如下圖)，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4. 用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入５倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分鐘，洗滌細胞兩次。
5. 末次離心后，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。
單個核細胞濃度(細胞數／1毫升細胞懸液)＝
4個大方格內細胞總數
────────── × 10４×2(稀釋倍數)
4
6. 細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
活細胞數
活細胞百分率＝────── ×100％
總細胞數
用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。
(三) 試劑和材料:
比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名為淋巴細胞分離液)。
Hank's液(無Ca２＋、Mg２＋)
10％小牛血清RPMI1640
0.2％臺酚蘭染色液，用生理鹽水或等滲的PBS配制。
肝素用Hank's液或生理鹽水稀釋成500單位／ml，牽9凝人外周血肝素用量約為50單位／1毫升血。
短中管、毛細滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
無菌干燥注射器針頭。
碘酒，75％酒精，無菌棉球，鑷子，橡皮止血帶。
血球計數板、顯微鏡、水平式離心機。
(四) 注意事項:
1. 抽取人外周靜脈血時要注意無菌操作。
2. 操作全程應盡可能短時間內完成，以免增加死細胞數。
3. 用淋巴細胞分離液分離PBMC時，離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等動物淋巴細胞比重與人不同，犛&配制相應密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
(五) 附錄
1. Hank's液(無Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl 8.0克
KCl 0.4克
Na２HPO４·12H２O 0.12克
KH２HPO４ 0.06克
葡萄糖 1.0克
雙蒸水 1000毫克
1％酚紅液 2毫克
將上列成分混合后溶化，分裝于500毫升鹽水瓶內，8磅15分鐘滅菌，4℃冰箱保存，臨用時調PH至7.3～7.6。
2. 細胞分層液配制法
9％聚蔗糖 24份
34％泛影葡胺 10％
混合，測比重為1.077～1.078，G５玻璃濾器過濾除菌。４℃冰箱保存備用。
3. 磷酸緩沖液(P
原液:
A液: 0.2M NaH２PO４溶液
NaH２PO４ 27.6克
或NaH２PO４·2H２O 31.2克
蒸餾水 溶解至 1000毫升
B液：0.2M Ha２HPO４溶液
Ha２HPO４·12H２O 71.6克
蒸餾水溶解至1000毫升
各種不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
───────────────────────────────────────
A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5
B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5
───────────────────────────────────────
舉例: 0.1M PH7.2PB
A液 28毫升
B液 72毫升
加蒸餾水 100ml
4. 血球保存液
葡萄糖 2.05克 枸椽酸鈉 0.8克
氯化鈉 0.42克 蒸餾水 100毫升
將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶(100毫升)。經10磅、10分鐘高壓滅菌。4℃保存備用。
5. RPMI-1640培養液:
RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋
三蒸水 1000毫升
電磁攪拌30分鐘：1N HCl調PH7.2～7.4(約加2.5毫升)，過濾除菌，作無菌試驗，4℃保存。
不完全RPMI-1640培養液:
RPMI-1640 95毫升
0.1M丙酮酸鈉 1毫升
0.2M谷氨酰胺 1毫升
1M Hepes 1毫升
7.5％ NaHCO３ 1毫升
青霉素、鏈霉素(各1萬單位) 1毫升
完全RPMI-1640培養液
不完全1640培養液 90毫升
滅活胎牛(或新生牛)血清 10毫升
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