MTT實驗原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項攻略
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MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍(lán) 為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。
mtt 粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
MTT步驟如下：
1、接種細(xì)胞：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。 2、培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間)。
3、呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul。繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
4、比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。
注意事項：
1、選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。 2、避免血清干擾：一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。 3、設(shè)空白對照：與試驗平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。
MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可!
舉個例子：
各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入計算公式：
Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025
參考公式：
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大劑量 I:lg(最大劑量/相臨劑量) P:陽性反應(yīng)率之和 Pm:最大陽性反應(yīng)率 Pn:最小陽性反應(yīng)率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值 公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率
例：
用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細(xì)胞活力，應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基，多少M(fèi)TT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定，一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。
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