細(xì)胞培養(yǎng)過程中的注意事項及試劑配制

四. 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒

器材與試劑：

干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH 計、磁力攪拌器。

具體步驟：

(1) 水的制備：

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.

(2)PBS 的制備與消毒( 也可用于其它BSS ，如：Hanks ，D-Hanks 液的配制) ：

1. 溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g ，KCl 0.2g ，Na2 HPO4? H2 O 1.56g ，KH2 PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml ，搖勻即成新配制的PBS 溶液。

2. 移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8 磅消毒20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

(3) 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：

胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在pH 為8.0 、溫度為37℃ 時，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS ，如：D-Hanks 液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。

1. 稱取胰蛋白酶： 按胰蛋白酶液濃度為0.25 ％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH 到7.2 左右）或PBS （D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于4℃ 內(nèi)過夜。

2. 用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃ 保存以備使用。

(4) 青、鏈霉素溶液的配制于消毒

1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15 磅高壓20 分鐘滅菌。

2. 具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80 萬單位/ 瓶，用注射器加4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是100 萬單位/ 瓶，加5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為20 萬單位。

3. 使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100 單位/ml 。1 單位＝1 微克？

(5).RPMI1640 的制備與消毒：

1. 溶解、調(diào)PH 值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3 的雙蒸水中, 并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3 次( 沖洗液一并加入培養(yǎng)基中), 充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙? 并按照包裝說明添加一定的藥品. 然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100 單位/ml 。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH 調(diào)PH 到7.2 左右。最后定容至1000ml ，搖勻。

2. 安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3. 抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。

4. 分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃ 冰箱內(nèi)待用。

5. 使用前要向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml 谷氨酰胺溶液（4℃ 時兩周有效）。

(6) 血清的滅活：

細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃ 水浴中滅火30 分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

(7)HEPES 溶液：

HEPES 的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH 范圍。使用終濃度為10-50mmol/L ，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES 即可達(dá)到緩沖能力。

1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：

準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容至1L 。過濾除菌，分裝后4℃ 保存。

注意：因為現(xiàn)在市售HEPES 為約10g 包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES 的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766 克HEPES 溶于20ml 三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml ）加入1L 培養(yǎng)液中，或者每100ml 培養(yǎng)液中加入2ml 即可。

(8) 谷氨酰胺：

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃ 下放置1 周可分解50 ％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃ 冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃ 冰箱中儲存2 周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1 ～4mmol/L 。可以配制200mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g 溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L 的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^濾除菌，分裝小瓶，-20℃ 保存，使用時可向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml 谷氨酰胺溶液。

(9) 肝素溶液的配制：

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml 。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56 克/ 瓶，配制時，可將其溶于100ml 三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為-- ℃ 。使用時，向100ml 培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml ）即可。

(10) Ⅰ 型膠原酶：

0.1 ％Ⅰ 型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ 型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml 小瓶-20℃ 保存。

(11). 明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1 ％明膠溶液必須用無菌的PBS 配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1 克（配成100ml 溶液）― 即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01. 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml 小瓶中，4℃ 保存。

(12) 其他培養(yǎng)用液的配制：

20ug/ml 內(nèi)皮生長因子，

注意事項：

1. 配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2. 安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45 微米和0.22 微米濾膜各一張，放置位置為0.45 的位于0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3. 配制RPMI1640 培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH 值最終為7.2 ，可在配制時調(diào)PH 至7.4 。

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