脂肪干細胞（ASCs）的提取及鑒定

一、實驗技術及原理

運用細胞培養技術、流式細胞術（體外擴增后ACSs的表型會發生改變，主要體現在細胞表面蛋白和細胞因子表達的變化），差異離心術（可將基質血管細胞沉淀與懸浮的成熟脂肪細胞分離，沉淀中除ASCs，還包括血細胞、成纖維細胞和內皮細胞，基質血管細胞沉淀可以接種到孰料培養瓶中，基質細胞可貼壁，造血和其他雜質細胞不貼壁，在隨后的傳代過程中被出去，最終得到的ASCs可再很長時間內保持摸分化狀態）。

取C57BL／6 WT小鼠2只，常規麻醉消毒，取腹股溝脂肪組織剪碎至糊狀，PBS液沖洗去麻藥及血液，0.075%II型膠原酶消化（37℃，30分鐘）以去除外基質，生理鹽水終止膠原酶的消化，離心（1 200 g，10分鐘），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重懸細胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細胞，離心洗滌，過200目銅網，得到單個核細胞。鏡下計數，按104個細胞/ml種植在培養瓶中，37℃ 5%CO2孵箱培養，24小時后第一次換液，以后3天換液一次，80%融合后0.25% Trypsin，0.02%EDTA消化傳代。細胞鏡下作形態學觀察及取第三代細胞用流式細胞儀作細胞周期及細胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定。

二、實驗用品

1. 材料：C57BL／6 WT小鼠。

2. 試劑：PBS液，0.075%II型膠原酶消化，10%FBS，低糖DMEM。

3. 儀器設備：超凈工作臺、恒溫培養箱、普通顯微鏡、倒置顯微鏡、離心機、離心管、解剖剪、眼科剪、鑷子（尖頭、平頭和有溝鑷）、小燒杯，200目銅網過濾器，低糖DMEM、血球計數板、橡皮瓶塞、酒精燈、換藥碗。

三、細胞培養的方法與步驟

1. 無菌操作的要領和要求。

2. 細胞原代培養

（1）操作步驟

a. 培養用品消毒后，安放在超凈工作臺內，紫外線消毒，做好洗手等準備工作。

b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常規麻醉消毒，取腹股溝脂肪組織剪碎至糊狀，PBS液沖洗去麻藥及血液。

c. 消化：將漂洗后的組織至于平皿中,加入膠原酶（0.075%II型膠原酶, PH），用量（0.1-0.3 ug/ml或200 U/ml），再用移液管移至燒瓶中，置于37℃水浴或恒溫箱中30分鐘），每隔5-10 min振蕩一次。30 min后，生理鹽水終止膠原酶的消化。

d. 離心和計數：將離心管做好標記，平衡后以（1 200 g，1 200 r/min 10分鐘），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重懸細胞沉淀，0.16 mol/L氯化氨溶解剩余紅細胞，將收集的細胞懸液經200目銅網過濾，1 200 r/min 離心10分鐘（先后順序），得到單個核細胞。加入培養液吹打混勻后取樣計數。根據計數結果調整細胞濃度為104個細胞/ml。

e. 接種培養：每10 cm2的培養瓶接種1 ml的細胞懸液，再添加4 ml的培養液，蓋緊瓶塞。標上名稱、組號和日期，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞分散情況后，置于37℃ 5%CO2孵箱培養。

（2） 觀察

每天對接種培養的細胞做常規性檢查。觀察的主要內容：污染與否、細胞生長狀態和pH（培養液顏色變化）等情況。如發現培養液變為檸檬黃色有渾濁，表明已被污染，細胞也就不易貼壁生長而逐漸死亡。如培養液顏色變為紫色，可能系培養瓶有裂口或瓶塞漏氣，CO2逸出或由于細胞生長不良有大量死亡。如培養液為橘紅色，一般說明細胞生長狀態良好。

在沒有發生污染，接種24h后，可見到許多細胞貼壁（由圓形懸浮狀態的細胞延展成短梭狀），24小時后第一次換液，以后3天換液一次。培養3-4天時，細胞生長繁殖，細胞數量增加，并可見細胞形成孤立小片（細胞島），逐漸擴展，細胞透明，顆粒啥，界線清晰。7-10天細胞已基本鋪滿瓶壁形成致密單層，（80%融合后）可進行傳代培養。

3. 細胞傳代培養

（1）操作步驟

a. 取一瓶脂肪干細胞在倒置相差顯微鏡下觀察，培養細胞如長成致密的單層，即可進行傳代。

b. 將培養瓶帶人超凈工作臺，倒去細胞培養液，吸取2ml-3ml PBS加入培養瓶中，輕輕振蕩后傾去，可重復進行一次。

c. 加入5-8滴0.25% Trypsin，0.02%EDTA，轉動培養瓶，使其濕潤整個細胞層，置于室溫下笑話2-3 min。翻轉培養瓶，肉眼觀察細胞單層，見細胞單層薄膜上出現******大小空隙時即可倒去消化液。如見消化程度不夠時可再延長消化1-2 min。如見細胞大片脫落，表明已消化過頭，則不能倒去消化液而直接進行下一步操作。

d. 加入3 ml培養液于培養瓶中終止消化。吸取瓶中培養液反復沖瓶壁上的細胞層，直至瓶壁上的細胞全被沖下，再輕輕吹打混勻，制成單細胞懸液。取樣計數，調整細胞濃度為104個細胞/ml。吸取1 ml細胞懸液加到另一培養瓶中，原瓶留下1 ml細胞懸液，棄去多余懸液（可分別提取1 ml接種分配到多個培養瓶中），并向每瓶中加4 ml培養液。蓋好瓶蓋，標上名稱、組號和日期，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞分散情況后，置于37℃ 5%CO2孵箱培養。

（2）觀察

細胞傳代后，每天對細胞進行觀察，注意污染與否、細胞貼壁和生長狀態等情況消化傳代。此過程中所做處理同原代培養。注意觀察細胞五個時期的特點（游離期、吸附期、繁殖期、維持期、衰退期）。

細胞已基本鋪滿瓶壁形成致密單層，這時可進行再次傳代培養。

四、細胞鏡下作形態學觀察及取第三代細胞用流式細胞儀作細胞周期及細胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定

1. 在細胞鏡下作形態學觀察，與正常形態比較（原代培養后，傳代2-3次，ACSs呈現單層，大而扁的細胞形態，其直徑在25-30 um，待細胞達到匯合時，它們形態上呈紡錘形，類似于成纖維細胞）。

2. 細胞周期分析

分別取生長融合達30%-40%和90%以上的第三代細胞，以4°C預冷的70%冰乙醇固定，4°C放置24小時；用PBS洗滌2次；加入RNA酶10ug和碘化丙啶（PI）0.3ml重懸細胞（4°C，30分鐘）。用流式細胞儀以FL2紅色熒光條件檢測。應用Modfit LT 2.0 軟件分析細胞周期。

取第三代細胞用流式細胞儀作細胞周期及細胞免疫表型（CD29/CD44）的鑒定。

3. 細胞表面分子免疫標記的鑒定

a. 方法：直接免疫熒光法

b. 試劑及材料：單克隆抗體 CD29 PE，CD44 PE,及同型對照抗體；細胞洗液：含2%BSA、0.1%NaN3的PBS；固定液：1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）；流式細胞儀。

c. 操作方法：

每個樣品取2只，分別標記同型抗體作為陰性對照、待測，分別加入106 個/100 ul待測細胞。對同型對照管中加入熒光標記單克隆抗體 CD29 、CD44 對照抗體作為陰性對照，待測管加入熒光標記單克隆抗體 CD29 PE，CD44 PE為實驗管，各20 ul，混勻。置于于室溫避光孵育 30分鐘，加入2 ml 的PBS，1 200 r/min 離心 10 min，棄上清，控干，加入固定液0.5ml（染色緩沖劑）。先測同型對照，再測實驗管。軟件采集數據，分析陽性細胞比例。

五、攜帶PTN表達基因的脂肪干細胞的獲取及鑒定

1. 實驗技術及原理：運用基因轉染技術，將帶PTN基因的反轉錄病毒載體轉染到脂肪干細胞，抗生素G418和流式細胞儀篩選，得到PTN高表達的脂肪干細胞。

2. 具體操作

（1）材料及試劑

（2） 脂肪干細胞的準備：被用于作靶基因轉染的細胞，其生長狀態如何，將直接決定了基因轉染效率。如為貼壁生長的細胞，一般要求在轉染前一日，必需應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，細胞密度以鋪滿培養器皿的60%為宜，轉染當日，在轉染前4小時換一將近新鮮培養液。對于懸浮細胞，也需在轉染前4小時換一次新鮮培養液。

（3）將帶PTN基因的反轉錄病毒載體轉染到脂肪干細胞，帶有PTN基因混合物應當逐滴加入，盡可能保持一致，從培養皿一邊到另一邊，邊加入邊輕搖培養皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。

（4）用抗生素G418和流式細胞儀篩選，得到PTN高表達的脂肪干細胞

G418篩選要做預試驗確定最佳濃度，將細胞稀釋至1 000 cell/ml，每孔100 ul加入有培養基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，100， 200，300， 400，500， 600，700， 800，900，1 000，1 100 ng/ml等１2個級別, 培養10-14天，以最低細胞全部死亡濃度為基準，一般400-800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。

流式細胞儀分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。

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