293細胞培養特性與培養基選擇

• 細胞培養基的配制 293細胞 細胞培養專題

1.培養基DMEM ++丙酮酸鈉++10%血清++青鏈霉素

2.復蘇：

(1)37度融化后，擦干凍存管 酒精擦，細胞加入15ml離心管，加5ml培養基，500g離心5min，棄上清，加1ml培養基重懸后加入到培養瓶中，5~6ml左右，記得晃勻。

3. 傳代 吸出舊培基，加5mlPBS 洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滾2遍吸出，37度放1min左右計時，看到變圓即加入新培基吹打 ，幾下就好了，分到新瓶里。

我個人認為：293細胞 貼壁后形成圓形，可能是細胞本身狀態不是很好，細胞不夠飽滿，細胞的貼壁后的棱角不易顯露出來，所以看上去類似圓形，而且細胞較小。

293細胞是用5型腺病毒75株系轉化，含有Ad5 E1區的人胚腎亞三倍體細胞系，是一種E1區缺陷互補細胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉染 技術構建而成。293細胞是貼壁依賴型呈上皮樣細胞，表現出典型的腺病毒轉化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。哺乳細胞的大規模培養方式有三種：貼壁培養、微載體 培養、無血清懸浮培養。這三種方式均可用于293細胞的大規模培養。293細胞在無Ca2+或含Ca2+培養基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養基中。單層培養細胞在5-10%FBS-DMEM中能生長很好。一般來講，1:10傳代后，一周可以長滿。嚴禁過度生長，這點很重要。因為會導致細胞密度加大和堆積，影響病毒斑的形成和轉染 ，傳代時也不易打散。懸浮的293細胞很容易大規模培養，但不容易長期保持穩定。293細胞在傳代120次以后，其表型可能改變，生長狀況不再完全是單層的了，偶爾會形成局部的細胞成團聚集，應立即拋棄，重新引入新傳代的細胞。

293細胞培養 特性：

1、293細胞明顯適應酸性環境,pH值在6.9～7.1時,可順利貼壁生長, 換液時動作要輕。一般用高糖的DMEM培養基 。

2、傳代：倒去廢液，PBS洗一次(輕)，用0.02%EDTA 與0.25%Trypsin消化，生長良好細胞，培養瓶中輕搖,使之流遍所有細胞表面,即將其吸除或棄去消化30s，然后吸去，再讓剩下的EDTA /Trypsin作用30s,鏡下觀察細胞變圓,就可加DMEM終止消化，反復吹打至細胞全成單個懸浮細胞即可。12小時-24小時90%以上細胞貼壁。293細胞傳代時機為達80-90%匯合，傳代比例為1：3。

3、293細胞在低代時容易貼壁，生長良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團，且貼壁不牢，用PBS沖洗時即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細胞懸液，最好購入時先大量凍存。

4、復蘇　293細胞的另一生長特性是貼壁所需時間長且貼壁不牢。細胞冷凍后復蘇時,都有不同程度的腫脹,若以50ml培養瓶待細胞長滿瓶底的70%～80%時消化凍存,復蘇時將其全部接種至2個50ml瓶中時較為合適。剛復蘇的293貼壁很慢，復蘇接種后24小時內,應盡量減少觀察細胞次數或不作觀察,以免因晃動而影響細胞貼壁。復蘇后48小時左右觀察貼壁情況并進行首次更換培養基比較合適,如果用一次性塑料培養瓶可增加細胞貼壁牢度。換液前宜將培養基預熱。

5、轉染：體外應用293細胞進行細胞轉染 時，如果是采用磷酸鈣轉染，一定要注意293細胞不要全部長滿細胞培養盤，長滿細胞時加入磷酸鈣就會使293細胞大片的脫落，最好是當293生長到1/2或2/3時進行磷酸鈣轉染，可以避免細胞的大量脫落。

其它的經驗：

1、用大瓶培養較小瓶要好，可能是更有利于293均勻的分布，利于營養的攝取

2、培養液要新鮮，每次只配1000ml，分為2-4瓶，不用的培養液，凍存在-20度，

3、要及時傳代，最好是細胞基本鋪滿培養瓶底部，但是細胞之間還沒有完全貼緊，總是多少有空隙的時候最好。

4、如果細胞貼壁不好，可能是消化過久，或是培養瓶不夠干凈，當然要除外細胞污染。

5、如果使用用玻璃培養瓶或皿，可以采用高壓滅菌的0.2%明膠溶液預處理培養瓶/培養皿，方法是將明膠加入培養皿，使之浸泡到底面的各個部分，然后吸出，置超凈臺內晾干即可使用。這樣處理后細胞貼壁效果好且鏡下細胞立體感強。如果是新的塑料培養瓶就不用處理。

培養基;GIBCO DMEM粉劑，加雙抗，HEPES，NaHCO3

配置高糖的DMEM培養基1000ml，

1.一袋DMEM培養基(GIBCOBRL)用去離子水 溶解

2.加入NaHCO3 2.0g

3.加入谷氨酰胺 0.146g(終濃度為5mM)

4.加入青霉素10萬U(終濃度100u/ml)，鏈霉素6.5萬U(終濃度100u/ml)

5.定容900ml

6.過濾除菌、分裝到兩個消毒的500ml瓶子中

7.加入滅活小牛血清100ml。

L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。

脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養液(含谷氨酰胺)在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L(29.22g/L)，配制時應加溫30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于-20℃。使用時，在每100ml培養液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

DMEMF11培養液――取15.6 g DMEMF11溶于700～800 mL超聲水中，加入3.7 g NaHCO3，用1 mol/L HCI或1 tool/L NaOH調節pH值至7.0～7.2，加超聲水定容至1 000 mL，0.22 p,m濾膜過濾，根據需要加入5% ～10%胎牛血清。

檸檬酸鹽細胞消化液――50 g KCI、22 g檸檬酸鈉加超純水至500 mL即為10×檸檬酸鹽細胞消化液，高壓蒸氣消毒(1.034×lo5 Pa)15 min后4℃冰箱貯存。臨用前以無菌超純水稀釋l0倍即為1×檸檬酸鹽細胞消化液。

低代次293細胞培養基 的配制DMEMF11 90 mL加FBS 10 mL，再加入青霉素和鏈霉素終濃度為100 U/mL。即為10%FBS的293細胞培養基 。

細胞的復蘇 快速取出凍存的低代次293細胞，將其安剖的底端1/2浸于37℃水浴中，輕輕晃動以加速融解。在超凈工作臺中，以70% 乙醇對細胞安剖表面消毒，將細胞轉移至75 cm 的細胞培養瓶中，加入10 mL低代次293細胞培養基置于細胞培養箱內培養。6～8 h后待細胞貼壁更換培養基。這與傳統的方法——離心洗滌后再轉人培養箱內培養不同。

細胞的傳代 待細胞的融合度至90% ，以1：2的比率傳代。首先吸出培養基，然后加入1×檸檬酸鹽細胞消化液3～5 mL洗2遍，留取0.5 mL 37℃消化5～10 min。將培養瓶在桌面輕輕敲打使細胞脫壁、漂浮、分散，為使細胞進一步分散可輕輕吹打幾次。然后加入培養基3 mL，溫和混勻，分別取1.5 mL細胞懸浮液加入2個25 cm 培養瓶中，再加入2 mL低代次293細胞培養基置于細胞培養箱內繼續培養。

細胞的凍存 待細胞融合度至90%左右，吸出培養基以1×檸檬酸鹽細胞消化液消化分散細胞，方法同細胞傳代。加入5 mL培養基中和消化液，200×g離心5 rain收集細胞沉淀，再以1 mL細胞凍存液(90%FBS+10%DMSO )重懸，一70℃或液氮中凍存。

文獻報道，該細胞在培養過程中不容易貼壁，生長活力低，易造成損傷，而且隨著傳代次數的增加包裝病毒的生物學特性會丟失。在培養過程中為減輕細胞損傷，可：

(1)利用低代次293細胞貼壁的特性，在復蘇和傳代時不離心，而是加入10 mL培養基中和細胞消化液，培養6～8 h，細胞貼壁后更換新鮮培養基，從而避免了離心剪切力對細胞造成的機械損傷;

(2)在消化細胞時，振蕩培養瓶，避免直接反復劇烈吹打細胞。細胞形態觀察、貼壁率和生長曲線表明，這種方法對細胞損傷小，能維持細胞較好的生長狀態。

NG等研究表明，低代次293細胞在培養過程中傳代時融合度過高或過低，其整合的腺病毒El區基因易丟失;另外，不適當的傳代比率也會導致細胞生物學特性發生改變。為此，筆者把細胞傳代的融合度控制在90%左右，傳代比率l：o以腺病毒感染質粒 pFG140感染傳l0代以后的低代次293細胞，可成功包裝出腺病毒，表明這種傳代方法可較好保持細胞的生物學特性。

本人也做過一段時間的293細胞培養，當時是用來擴增腺病毒的。看了樓主的描述，我覺得不貼壁與你3小時后的擾動關系不大。我倒是覺得你種細胞的濃度太 大。為什么要將15瓶的細胞收集起來再分別種于8個培養皿呢?濃度太大了。要知道293長到一定程度(>80%)的時候細胞的特性會發生變化。我一 般是將一瓶細胞懸浮，分別種于于2-3個培養皿中，然后讓其生長到80-90%滿，加入病毒原液。等到所有細胞變圓飄起就說明擴增過程完成了。這樣培養 293在轉染前的狀態是最好的，對病毒擴增最有利!不像你的方法，一下種那么密，就算都能貼壁，那時的細胞密度已經接近80-90%，況且細胞都是才傳代 的，狀態肯定沒有稀釋培養法好。另外，給你個重要的提示：293細胞很容易吹打下來。不需要使用胰酶，反復吹打即可。長到80%的細胞更容易吹下來!胰酶 對293細胞的傷害很大，即使你的消化時間很短。

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