線粒體和液泡系的超活染色與觀察
活體染色是能使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色但對活樣品又沒有毒害作用的一種活體染色方法，其目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活體染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。
根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體內(nèi)活體染色是以膠體狀的染料溶液注入動、植物 體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識別的目的。
體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學(xué)”特性。
堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色，理論上應(yīng)選擇那些對細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，且使用時需要配成稀淡的溶液。
一般說來，最為適用的是堿性染料，這可能是因為它具有溶解在類脂質(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B(Janus green B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。
實 驗 目 的
1. 觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；
2. 學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器 的超活染色技術(shù)。
實 驗 原 理
線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基(即無色狀態(tài))。
中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。
實 驗 用 品
一、器材
顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤．載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。
二、試劑
1. Ringer溶液：
氯化鈉 0.85g (變溫動物用0.65g)
氯化鉀 0.25g
氯化鉀 0.25g
氯化鈣 0.03g
蒸餾水 100ml
2. 10%、1/3000中性紅溶液：
稱取0.5g中性紅溶于50ml Ringer液，稍加熱 (30~40℃)使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混勻，裝入棕色瓶備用。
3. 1%、1/5000詹納斯綠B溶液
稱取50mg詹納斯綠B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微熱(30~40℃)，使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。
三、材料
人口腔上皮細(xì)胞，小麥種子或黃豆幼根根尖。
實 驗 方 法
一、 人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察
清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上
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滴2滴1/5000詹納斯綠B染液
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用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞
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刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中
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染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液)
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蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察
二、植物細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察
取豆芽的根尖
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用刀片縱切根尖
放入中性紅染液滴中，染色5~10min。
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吸去染液，滴一滴Ringer液
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蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察)
實 驗 結(jié) 果
在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。
然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。
作 業(yè)
1. 繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布
2. 繪蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞示液泡系的形態(tài)與分布
思 考 題
1. 用一種活體染色劑對細(xì)胞進(jìn)行超活染色，為什么不能同時觀察到線粒體、液泡系等多種細(xì)胞器?
答：不同的活體染色劑對不同的細(xì)胞器有染色專一性。詹納斯綠B(Janus green B) 僅對線粒體具有專一性，而對液泡系沒有專一性；中性紅(neutral red)則對液泡系具有專一性，而對線粒體沒有專一性。因此，用一種活體染色劑對細(xì)胞進(jìn)行超活染色時，不能同時觀察到線粒體、液泡系等多種細(xì)胞器。
2. 小麥或黃豆根尖經(jīng)中性紅超活染色，為什么看到生長點(diǎn)的細(xì)胞中液泡多，而且染色深，延長區(qū)細(xì)胞中液泡數(shù)量變少，染色淺?
答：因為生長點(diǎn)處的細(xì)胞分裂旺盛，且較小，處于新生階段，故液泡數(shù)量多、染色深；而延長區(qū)的細(xì)胞已經(jīng)成熟，細(xì)胞分裂能力下降，且細(xì)胞較大，因此細(xì)胞中液泡數(shù)量變少、染色變淺。
3. 高等動物和高等植物細(xì)胞中的液泡系(高爾基體)分布上有何不同?
答：高等動物中高爾基復(fù)合體一般都位于細(xì)胞核附近；而高等植物中高爾基體彌散于整個細(xì)胞中，不集中。
