細胞器的分離實驗

細胞由細胞膜、細胞核 和細胞質(zhì)組成，細胞質(zhì)中含有若干細胞器和細胞骨架等，這些也稱作亞細胞組分。對于細胞的結構和功能的研究，是細胞生物學的基本課題，其重要的研究手段之一是分離純的亞細胞組分，觀察它們的結構或進行生化分析。分離亞細胞組分的方法主要有差速離心和密度梯度離心。

差速離心(differential centrifugation)

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 與高基體、最后為核蛋白體。

由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復2～3次效果會好一些。

差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。

密度梯度離心(density gradient centrifugation)

用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。

這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。

A等速度沉降，B等密度沉降

密度梯度離心

速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒(細胞或細胞器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。

等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細胞器，而不太適于分離和純化細胞。

葉綠體的分離

實驗方法

1.選取新鮮的嫩菠菜葉片，洗凈擦干后去除葉梗和粗脈，撕成小碎塊，稱3g放于玻璃勻漿器中，加入10ml 0.35M NaCl 溶液，勻漿3～5min。

2.勻漿液用4層紗布過濾于50ml燒杯中。

3.將濾液平分到2個離心管中，天平配平，1 000r/min下離心2min。棄去沉淀。

4.將上清液在3 000r/min下離心5min。棄去上清，沉淀即為葉綠體。

5.將沉淀用0.35M NaCl 溶液懸浮，取一滴葉綠體懸液滴于載片上，加蓋片觀察：

①在普通光鏡下觀察;②在熒光顯微鏡下觀察。

實驗結果

1.普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。

2.熒光顯微鏡下，選用藍色激發(fā)濾光片，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。