利用細胞計數板測定血細胞數量及大小

細胞計數是細胞培養 中常用的技術，通過細胞計數可以知曉細胞的生長狀態，繪制細胞生長曲線。細胞計數板是常用細胞計數的器材，具體實驗步驟如下：

一、 目的與要求

1. 掌握用血球計數板進行細胞直接鏡檢計數的方法。

2. 學習測量細胞大小的方法。

二、 實驗原理

動物組織細胞的體外培養、血液中血細胞數量的變動、許多產品的細菌 學檢查、微生物培養等科研、生產和臨床上常常需要檢測細胞的數量。測定細胞數量的方法有很多種，其中，用血細胞計數板于顯微鏡下直接計數的方法樣品用量少，操作簡便、快速、直觀，是一種較常用的細胞計數方法。

血細胞計數板由一塊長約7.5cm、寬3.5cm的厚玻璃制成，在中部1/3面積處有4條槽，內側兩條槽之間還有1條橫槽相通，在中部構成2塊長方形平臺。此平臺比整個載玻片平面低0.1mm。平臺中部各有一個計數室，每個計數室分九大格，每格邊長1mm，面積為1mm2，蓋上蓋玻片后體積為0.1mm3。

四角的大格被劃分為16個中方格，一般用作白細胞、血小板及組織培養的細胞計數。中央的大方格則由雙線劃分為25個中方格，每個中方格面積為0.04mm2，蓋上蓋玻片后體積為0.004mm3，每個中方格又分成16個小方格，用于紅細胞、微生物 細胞的計數。

細胞的大小和形態依細胞種類不同各異，通常血細胞呈橢圓形或圓球形，直徑在10?m左右，按公式V=4/3?ab2(a為長半徑，b為短半徑)可求出細胞體積。因此，測量細胞體積首先要用測微尺測出細胞的長半徑和短半徑。

常用的測微尺有目鏡測微尺和物鏡測微尺兩種。目鏡測微尺為一塊圓形的薄玻璃片，直徑20-21mm，正好能放入目鏡的鏡筒內，其上面刻有不同形式的標尺。標尺有直線式和網格式兩種，直線式又分為“十”字形和“一”字形兩種。直線式測微尺總長10mm，分為10大格，其上有數字指示，每一大格又分10小格，共100小格。網格式測微尺常用來測量面積或計數。

物鏡測微尺是一種特制的載玻片，其中央有一個圓圈，圈內具有一個有刻度的標尺，為直線式標尺，全長1mm，分為10大格，每大格又分10小格，共100小格。每小格長度為0.01mm，即10?m。

由于目鏡測微尺刻度的長度隨物鏡放大倍數不同而有改變，所以用目鏡測微尺測量細胞前，首先要測定目鏡測微尺的長度，即使用物鏡測微尺來確定目鏡測微尺刻度的長度，然后再以目鏡測微尺上的刻度作為測量細胞時的度量單位。

三、 材料和用具

顯微鏡、載玻片、蓋玻片、血球計數板、采血針、干消毒棉球、移液器、試管、滴管、目鏡測微尺、物鏡測微尺、計數器。

75%乙醇、紅細胞稀釋液、白細胞稀釋液。

四、 操作與觀察

(一) 血細胞計數

1. 用1mL移液器準確吸取0.38mL白細胞稀釋液放入一支干凈的小試管內，加塞備用。用5mL移液器準確吸取3.98mL紅細胞稀釋液，放入一支干凈的中試管內，加塞備用。

2. 用消毒棉球蘸75%乙醇消毒左手無名指或耳垂邊緣，待酒精揮發后用采血針刺入皮膚2-3mm深，讓血液自然流出。

(注意：必須待酒精揮發后用才能采血，否則流出的血液不成滴，無法吸取。)用干消毒棉球拭去第1滴血液，待第2滴血液成大滴時，用移液器吸20?l血,再將移液器內的血趁出血處尚有血液流出，換1個槍頭用移液器吸取20?l血液放入盛有紅細胞稀釋液的試管底部。

輕輕搖振試管1-2min，混勻稀釋的血液，但不可用力過猛，以免產生泡沫。

3. 充液：用擦鏡紙將計數板擦干凈，蓋上蓋玻片。用移液器吸取20?l稀釋的血液，滴在計數板上蓋玻片的邊緣，使其依靠毛細現象自動流入計數室內。一般應一次充液使計數室內充滿稀釋血液，若經幾次充液，易形成氣泡，應洗凈計數板和蓋玻片，干燥后重新充液。紅細胞和白細胞應分兩次充液。

4. 計數：為防止重復計數和漏數，計數時應遵循一定的順序，對正好壓在格線上的細胞，依照“數上不數下，數左不數右”的原則進行計數。如果計數白細胞時發現各大方格的白細胞相差8個以上或計數紅細胞時發現各中方格的紅細胞相差20個以上，表明血細胞分布不均勻，須將稀釋的血液搖勻后再重新充入計數室計數。

5. 計算：

(1)白細胞數：將四角的四個大方格內數得的白細胞總數乘以50，即得每立方毫米血液內的白細胞總數。為什么?

(2)紅細胞數：將中央大方格的四角和中央共五個中方格內數得的紅細胞總數乘以10000，即得每立方毫米血液內的紅細胞總數。為什么?

(3)按目前臨床上血細胞計數采用的通用單位，將以上結果換算為每升血液中各種血細胞的數量。

將結果填入下表： 計算

次數 4個大方格白細胞數 5個中方格紅細胞數

1 2 3 4 總數 1 2 3 4 5 總數

第1次

第2次

兩次平均總數

血細胞計數 ×109/L ×1012/L

(二) 血細胞大小的測量

1.安裝與校尺

(1)將物鏡測微尺置于顯微鏡下(刻度面朝上)，用低倍鏡觀察，慢慢調焦，找到物鏡測微尺刻度。

(2)取下目鏡，旋下目鏡上蓋，將圓形目鏡測微尺放入鏡筒中，旋上目鏡蓋后把目鏡放回鏡筒內。

(3)觀察并調整目鏡測微尺與物鏡測微尺的位置，使兩尺平行，找出兩尺刻度完全重合的兩個位置，記錄并按下式計算：

例如，重合兩處之間目鏡測微尺有50小格而物鏡測微尺有68小格，則目鏡測微尺每格長度為68/50×10 = 13.6??m。

(4)以同法用其它物鏡測定目鏡測微尺每格的長度。

2. 測量細胞體積：取下物鏡測微尺放入保護盒內，換上血涂片，用目鏡測微尺測量紅細胞和白細胞的長度與寬度，取其一半為長半徑和短半徑，代入公式求體積。測量完畢后小心取下目鏡測微尺，包裝后放回盒內。

3. 計算：V=4/3?ab2(a為長半徑，b為短半徑)。如果血細胞是圓球形，其體積V=4/3?R3(R為半徑)。為減少誤差，同一標本需測5個細胞的數據，取其平均值計算體積。

注意事項：測量細胞大小的時候，不影響更換物鏡觀察，如果需要更換物鏡則進行測量細胞大小，則需要重新校準物鏡。