第一代腺病毒載體重組的常見方法

1.細胞內同源重組

這種方法需要在兩個DNA分子之間進行重組，第一個DNA分子(即所謂穿梭載體，shuttle vector)含有腺病毒左側的反向末端重復序列（LITR）、腺病毒包裝信號（ψ）等順式作用元件以及目的基因表達盒和腺病毒基因組的左端一段序列；另一個DNA分子（即骨架載體，backbone vector）與第一個DNA分子的3′端略微重疊，然后繼續向右，包含有大部分的病毒基因組序列。

兩種DNA分子共轉染入可以表達腺病毒E1區蛋白的細胞（如293、911以及PERC6等），并發生同源重組，即可得到預期的復制缺陷型重組腺病毒。其缺點是：容易受到親代病毒的污染，必須經過2-3次的病毒空斑純化，并通過多次的嗜斑形成方法鑒定重組病毒。

另外，重組效率低下，重組腺病毒通常需要花費兩周左右的時間。雖說如此，本方法是構建腺病毒載體的經典方法，目前應用于臨床的腺病毒載體都是以這種方法構建的。因此，若是構建重組腺病毒的最終目標是成功地應用于臨床還是以這種方法為佳。

而且難度是相對的，對于一個在構建重組腺病毒方面有著經驗豐富的實驗室而言，以這種重組方法在較短的時間內成功構建出重組腺病毒并非很困難。

2. 位點特異性重組系統

位點特異性重組(site-specific recombination)是發生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發生需一段同源序列即特異性位點(又稱附著點attachment site)和位點特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。

重組酶只能催化特異性位點間的重組,不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組,因而重組具有特異性和高度保守性。據此，位點特異性重組又稱保守重組(conservation recombination)，該重組過程不需RecA酶參與。

目前應用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統，其中Cre、FLP和BP均為特異性重組酶，屬重組酶λ整合酶家族，它們催化的反應類型、靶位點及重組機制十分相似，loxP、FRT和attBP為特異性位點，也有相似的結構。我們將以Cre/loxP為例作一簡要介紹。

Cre基因表達產物為343個氨基酸的單聚體蛋白，分子量為38kDa，它是位點特異性重組發生所需的特異性重組酶,其識別位點被稱為loxP(locus of crossing-over P1)，為一段34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的不對稱間隔序列(又稱為核心序列)組成5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′。

loxP位點堿基重排后形成十字形的結構，核心序列形成一單鏈環，它為Cre重組酶切割的底物，也是DNA識別與重組的位點，對稱的13bp反向重復序列是Cre重組酶結合的序列。

位點特異性重組酶Cre很特別，由它介導的重組反應不需要ATP或拓撲異構酶等輔助因子的參與；重組反應既可以發生于體內、外的活細胞內，也可以發生于無細胞系統之中；重組反應的底物形式多樣，無論是源于動物、植物或微生物的DNA，還是線性、開環或超螺旋的DNA均適用。

Cre的特定作用位點loxP的位置也極富變化，可以位于相同或不同的染色體或DNA分子上，loxP之間既可同向排列、也可反向存在。

在同一個DNA分子上，Cre介導兩個同向排列loxP位點之間的DNA的缺失反應(在DNA分子上留下一個loxP位點)，被切除的DNA分子呈環狀。如果該環狀結構具有質粒的基本元件和抗性基因，則可在用其轉化大腸桿菌后形成抗性菌落。

如果兩個loxP位點反向排列，Cre則誘發倒位反應。在不同的DNA分子上，Cre則介導缺失、重復、插入以及易位等反應。

Cre/LoxP位點特異性重組系統也是由穿梭載體和骨架載體構成，各含有一個同向排列的LoxP位點，其中骨架載體還含有由CMV啟動子調控的Cre基因。將穿梭載體與骨架載體共轉染包裝細胞株（293、911以及PERC6等），骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達，介導兩個LoxP位點之間的重組，剪切掉骨架載體上的細菌內復制元件、抗性基因以及Cre基因，同時完成目的基因的插入。

由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號（ψ），而穿梭載體則剛好相反，因此只有在兩個載體之間發生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒。通過這種方法轉染7~10天后就能觀察到病毒噬菌斑。

這種方法比前一方法獲得重組腺病毒的效率要高很多（約100倍），而且只要插入的外源基因不大于8Kb，那么幾乎100%的重組腺病毒都攜帶有目的基因。不難看出，這是一種非常便捷的腺病毒重組方法，非常適用于在構建重組腺病毒載體方面經驗較少的實驗室。

最近，由BD公司推出了一套在體外利用Cre/LoxP位點特異性重組構建腺病毒載體的系統。該系統也是由一大（受體）一小（供體）兩個質粒載體構成。

供體載體包含兩個LoxP位點，分別位于多克隆位點的5′端和氯霉素抗性基因（Cmr）開放閱讀框的5′端，另外還含有氨芐抗性基因（Ampr）和蔗糖酶B基因（SacB），前者用于在大腸桿菌中保持載體遺傳性狀的穩定，后者在重組后作負性選擇之用。

受體載體含有一個LoxP位點，緊隨其后的是一個可以在 Cre/LoxP介導重組后調控Cmr表達的細菌啟動子。三個LoxP位點為同向排列，在Cre酶的作用下同時發生多個重組反應，一部分重組反應將目的基因和Cmr轉移到受體載體中。

由于供體載體及其衍生物（由一些意外重組事件產生）中都含有SacB基因，在含蔗糖的培養基中不能生長，而受體載體及其衍生物在含氯霉素的培養基中不能生長，因此將重組反應產物轉化E.coli DH5α并鋪LB/Cm/蔗糖平板后，只有正確的重組子可以生長。

將正確的腺病毒重組子用PacI酶消化，暴露其反向末端重復序列，轉染低代293細胞，經過7~10天即可得到攜帶有目的基因的重組腺病毒。

這種方法的優點是：①酶切與連接步驟少；②正確的重組機率高，可達90%以上；③無需反復空斑純化。

3. 細菌內同源重組（AdEasyTM System）

這種方法的基本策略是：在大腸桿菌內通過同源重組的方法構建重組腺病毒質粒載體，經酶切線性化后再轉染腺病毒包裝細胞系（293、911以及PERC6等），從而得到腺病毒感染顆粒。與哺乳動物細胞比較，在大腸桿菌內進行挑克隆、鑒定等操作無疑要便利許多，因此這種方法已被國內許多實驗室所采用。

然而，由于在大腸桿菌中腺病毒序列的遺傳選擇壓力較小，發生突變導致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核細胞內重組的方法。這種方法的共同特點是：

重組系統由兩種質粒組成，一種是包含有全部（或右側大部分）腺病毒基因組DNA的大質粒（骨架質粒）；另一種是小的穿梭質粒，其帶有目的基因表達盒以及在表達盒兩側的與大質粒上的目的基因擬插入部位同源的序列（左、右臂 Left Right Arm）。

這種方法通常的操作流程是：首先，將目的基因亞克隆到穿梭載體中，經過一個在穿梭載體左右臂之間的稀有的限制性內切酶消化，暴露其左右臂；然后，與環化（或超螺旋）的骨架質粒載體共轉化RecA酶陽性的大腸桿菌（如BJ5183），使二者發生同源重組，得到攜帶目的基因的腺病毒重組子質粒；

再后，用另一稀有的限制性內切酶充分消化腺病毒重組子質粒，切除質粒上的原核細胞內復制元件及抗性基因等，使其線性化并暴露左右末端重復序列（ITR）；最后，轉染腺病毒包裝細胞系（293、911以及PERC6等），得到腺病毒感染顆粒。以AdEasyTM系統為例，構建流程如下：

AdEasyTM系統是由TONG-Chuan He博士等（1998）構建的用來代替傳統腺病毒重組系統的一個快捷系統。該系統的特點是：

1)有多種穿梭載體可供選擇（pShuttle、 pShuttle-CMV、pTrack、和pTrack-CMV）。其中pTrack和pTrack-CMV攜帶有報告基因EGFP（綠色熒光蛋白），轉染293細胞后可于熒光顯微鏡下直接挑選陽性克隆，非常直觀、簡便。

2)酶切和連接反應少，減化了操作步驟。

3)通過上面的流程圖不難看出，當骨架質粒與線性化的穿梭質粒發生同源重組后，其抗性基因將由原來的氨芐抗性轉變為卡那抗性，信噪比得到明顯的提高。
4) E.coli BJ5183內的RecA酶是一種高效的同源重組酶，正確的同源重組率在60%以上。

不足之處在于：該系統中的骨架載體需以超螺旋的形式（需經超速離心純化才能獲得）與線性化的穿梭質粒一起點穿孔轉化E.coli BJ5183，才可以保證有較高的同源重組機率，這對于國內一些設備和技術相對落后的實驗室而言無疑是有一定的難度的。

另外如前所述，由于在大腸桿菌中腺病毒序列的遺傳選擇壓力較小，發生突變導致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核細胞內重組的方法，因此應多挑選幾個重組子克隆轉染293細胞，并從中選出重組病毒活力強、目的基因表達量高的克隆用于實驗。

我實驗室在對該系統進行了一些改進后，使其更方便易行，更適合我國國情，并取得了較好的效果。具體步驟見實驗操作部分。

4. 酶切連接

本方案的基本思路實在腺病毒質粒中通過連接反應插入一個表達盒，而不是進行同源重組。這個系統中也含有穿梭和骨架兩種載體。大質粒含有除E1和/或E3區外的全部腺病毒基因組，其E1區缺失部位有兩個非常罕見的由內含子編碼的核酸內切酶位點（如，PI-Sce I和I-Ceu I）。

穿梭載體較小、易于操作，用于將目的基因表達盒亞克隆到腺病毒骨架質粒載體中，在穿梭載體多克隆位點的兩側也含有上述特殊的酶切位點。首先將目的基因表達盒插入到穿梭載體中，用上述兩種酶消化之.

得到含有目的基因表達盒的穿梭載體片段與腺病毒骨架質粒（用兩種酶預消化后）連接，轉化E.coli DH5α即可得到腺病毒重組子克隆，將其用PacI消化暴露其反向末端重復序列后轉染低代293細胞，得到帶有目的基因表達盒的重組腺病毒。

這種方法的優點是：克隆的效率可達90%，整個重組過程僅需10~17天即可完成；只用一種相同的大腸桿菌株，質粒的構建和擴增很迅捷；產生以外重組事件和產生非感染性病毒DNA的幾率比前述的細菌內同源重組的方法要更小一些。

不足之處在于：首先，正如我們前面提到的，由于在大腸桿菌中腺病毒序列的遺傳選擇壓力較小，發生突變導致腺病毒活力下降的可能性要高于真核細胞內重組的方法；其次，兩種罕見酶PI-Sce I和I-Ceu I的價格昂貴，PacI也非常貴，因此這種方法的成本較高。