病毒滴度的測定

稀釋計數法

滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。”TU”為”transducing units”的縮寫，中文為“轉導單位”，表示可以感染并進入到靶細胞中的病毒基因組數。

第一天細胞準備

將生長狀態良好的293T細胞消化計數后稀釋至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，為每個病毒準備10個孔。放入37℃，5%CO2培養箱中培養。

第二天加病毒

在EP管中做10倍梯度稀釋，連續10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備10個1.5ml EP管，每管加入90μl培養液，往第一個管中加入10μl病毒原液，混勻后，吸取10μl加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培養基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標記。

第三天追加培養液

在每個孔再加入100μl完全培養液，利于細胞的生長。

第五天觀察結果并計算滴度

在熒光顯微鏡下觀察結果，并數出最后兩個有熒光的熒光細胞克隆數。假設為X和Y，則滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl ）。

定量PCR法

病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細胞。每孔細胞為5×104個。

接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數板計數，確定感染時細胞的實際數目，記為N。

棄去其他培養板中的培養基，更換為含有5μg/ml polybrene的新鮮培養基。將濃縮病毒用培養基稀釋200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培養基中。在3個培養孔中分別加入0.5μl，5μl和50μl的稀釋病毒。

感染開始后20小時，除去培養上清，換為500μl含DNaseI 的新鮮培養基。在37℃消化15分鐘，這一步是要除去殘余的質粒DNA。然后換為2ml正常的培養基，繼續培養48小時。

用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37℃放置1分鐘。用培養基吹洗下，離心收集細胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200μl洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量（Bio-Rad）。基因組DNA可以穩定保存在-20℃至少2個月。

準備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管Ⅰ：

n = number of reactions。例如：總反應數為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。震蕩后放在冰上。

n = number of reactions。例如：總反應數為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震蕩后放在冰上。

在預冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，從總管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。

分別取5μl質粒標準品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照（no-template control）。

分別取5μl基因組標準品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個樣品重復1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照（no-template control）。

所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7000定量系統。循環條件設定為：50℃ 2分鐘，95℃10分鐘，然后是95℃15秒，60℃1分鐘的40個循環。

數據分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數用基因組數加以標定，得到每基因組整合的病毒拷貝數。

滴度（integration units per ml，IU ml-1）的計算公式如下：
IU ml-1= (C ×N× D×1000)/V

其中：C = 平均每基因組整合的病毒拷貝數；N = 感染時細胞的數目（約為1×105）D = 病毒載體的稀釋倍數；V = 加入的稀釋病毒的體積數。