RNA提取的基本操作步驟
RNA的提取準備試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇，無RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)
操作步驟：
1. 勻漿處理：
① 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10%。
② 單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
③ 細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106 動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。
6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
7. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
8. 用75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。
9. 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心干燥，過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。
注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。
2．勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3．分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600×g離心30-60分鐘。
預期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg 。
常見問題分析：
1. 得率低：
① 樣品裂解或勻漿處理不徹底
② RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 ：
① 檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高
② 樣品勻漿時加的試劑量太少
③ 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘
④ 吸取水相時混入了有機相
⑤ RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
① 組織取出后沒有馬上處理或冷凍
② 待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃
③ 細胞在用胰酶處理時過度
④ 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理
⑤ 電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染：
① 樣品勻漿時加的試劑量太少
② 樣品中含有有機溶劑(如乙醇，DMSO等)，強緩沖液或堿性溶液
蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心，按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。
