熒光共振能量轉移技術的基本原理和應用
熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作為一種高效的光學“分子尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面有廣泛的應用。在分子生物學領域，該技術可用于研究活細胞生理條件下研究蛋白質-蛋白質間相互作用。
蛋白質-蛋白質間相互作用在整個細胞生命過程中占有重要地位，由于細胞內各種組分極其復雜，因此一些傳統研究蛋白質-蛋白質間相互作用的方法如酵母雙雜交、免疫沉淀等可能會丟失某些重要的信息，無法正確地反映在當時活細胞生理條件下蛋白質-蛋白質間相互作用的動態變化過程。FRET技術是近來發展的一項新技術，為在活細胞生理條件下對蛋白質-蛋白質間相互作用進行實時的動態研究提供了便利。
一、FRET技術基本原理
熒光共振能量轉移是指兩個熒光發色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移（即發生能量共振轉移）。
FRET是一種非輻射能量躍遷，通過分子間的電偶極相互作用，將供體激發態能量轉移到受體激發態的過程，使供體熒光強度降低，而受體可以發射更強于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發熒光（熒光猝滅），同時也伴隨著熒光壽命的相應縮短或延長。能量轉移的效率和供體的發射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對取向、供體與受體之間的距離等因素有關。作為共振能量轉移供、受體對，熒光物質必須滿足以下條件：
①受、供體的激發光要足夠分得開；
②供體的發光光譜與受體的激發光譜要重疊。
人們已經利用生物體自身的熒光或者將有機熒光染料標記到所研究的對象上，成功地應用于核酸檢測、蛋白質結構、功能分析、免疫分析及細胞器結構功能檢測等諸多方面。（傳統有機熒光染料吸收光譜窄，發射光譜常常伴有拖尾，這樣會影響供體發射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，而且供、受體發射光譜產生相互干擾。最新的一些報道將發光量子點用于共振能量轉移研究，克服了有機熒光染料的不足之處。
相對于傳統有機熒光染料分子，量子點的發射光譜很窄而且不拖尾，減少了供體與受體發射光譜的重疊，避免了相互間的干擾；由于量子點具有較寬的光譜激發范圍，當它作為能量供體時，可以更自由地選擇激發波長，可以最大限度地避免對能量受體的直接激發；通過改變量子點的組成或尺寸，可以使其發射可見光區任一波長的光，也就是說它可以為吸收光譜在可見區的任一生色團作能量供體，并且保證了供體發射波長與受體吸收波長的良好重疊，增加了共振能量轉移效率。）
以GFP的兩個突變體CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）為例簡要說明其原理：CFP的發射光譜與YFP的吸收光譜有相當的重疊，當它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發，CFP的發色基團將會把能量高效率地共振轉移至YFP的發色基團上，所以CFP的發射熒光將減弱或消失，主要發射將是YFP的熒光。兩個發色基團之間的能量轉換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏。例如要研究兩種蛋白質a和b間的相互作用，可以根據FRET原理構建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質b、YFP（yellow fluorescent protein）。
用CFP吸收波長433nm作為激發波長，實驗靈巧設計，使當蛋白質a與b沒有發生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發生熒光共振能量轉移，因而檢測到的是CFP的發射波長為476nm的熒光；但當蛋白質a與b發生相互作用時，由于蛋白質b受蛋白質a作用而發生構象變化，使CFP與YFP充分靠近發生熒光共振能量轉移，此時檢測到的就是YFP的發射波長為527nm的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉基因技術使其在細胞內表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質-蛋白質間的相互作用。
二、FRET技術的應用
隨著生命科學研究的不斷深入，對各種生命現象發生的機制，特別是對細胞內蛋白質-蛋白質間相互作用的研究變得尤為重要。而要想在這些方面的研究取得重大突破，技術進步又是必不可少的。
一些傳統的研究方法不斷發展，為蛋白質-蛋白質間相互作用的研究提供了極為有利的條件，但同時這些研究手段也存在不少缺陷：如酵母雙雜交、磷酸化抗體、免疫熒光、放射性標記等方法應用的前提都是要破碎細胞或對細胞造成損傷，無法做到在活細胞生理條件下實時的對細胞內蛋白質-蛋白質間相互作用進行動態研究。FRET技術的應用結合基因工程等技術正好彌補了這一缺陷，下面是FRET技術在相關生命科學領域中的具體應用。
1、檢測酶活性變化
（1）活細胞內檢測蛋白激酶活性
蛋白質磷酸化是細胞信號轉導過程中的重要標志，研究其中的酶活性是研究信號通路的一個重要方面。以前酶活性測定主要是利用放射性以及免疫化學發光等方法，但前提都是要破碎細胞，用細胞提取物測定酶活性，還無法做到活細胞內定時、定量、定位的觀測酶活性變化。
而利用FRET方法就可以很好的解決這個問題：如Zhang等人利用FRET原理設計了一種新的探針（一種融合蛋白）：新探針包含一個對已知蛋白激酶特異性的底物結構域，一個與磷酸化底物結構域相結合的磷酸化識別結構域。這個探針蛋白的兩端是GFP的衍生物CFP與YFP，利用FRET原理工作。
當底物結構域被磷酸化后，分子內部就會發生磷酸化識別結構域與其結合而引起的內部折疊，兩個熒光蛋白相互靠近就會發生能量遷移。如果磷酸酶進行作用將其去磷酸化，分子就會發生可逆性的變化。該研究小組用幾組嵌合體來研究四種已知蛋白激酶的活性：PKA（protein kinase A）、Src、Abl 、 EGFR（epidermal growth factor receptor）。
他們將構建的報導探針轉入細胞，根據FRET來檢測激酶活性變化。對細胞進行生長因子處理后，幾種酪氨酸激酶都在幾分鐘內被激活，檢測到25%-35%的活性變化。用forskolin激活PKA能增強FRET 25%-50%的變化，激酶在整個細胞質范圍內被激活。如果將報導探針加上核定位信號使之定位于核中，則FRET變化被極大的延遲了，這也說明了PKA作用的區域性。由此可見，利用FRET方法可以很好的觀察活細胞內酶活性變化，并且能做到定時、定量、定位，是一種非常有效的研究手段。
