免疫熒光技術(shù)
簡(jiǎn)介
免疫熒光技術(shù)是指將抗原抗體反應(yīng)和熒光標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合使用以鑒定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的方法。
原理
根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先固定表達(dá)抗原的細(xì)胞，而后加入雜交瘤上清液（一抗），最后加入 FITC-二抗檢查細(xì)胞內(nèi)外是否有單克隆抗體結(jié)合。
若為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，則可在細(xì)胞上形成具有熒光素的抗原抗體復(fù)合物。熒光素受激發(fā)光照射會(huì)發(fā)出明亮的熒光，用熒光顯微鏡觀察可以看到是否有熒光存在以及熒光強(qiáng)度，從而確定雜交瘤細(xì)胞株是否為陽(yáng)性，并進(jìn)行定量。
用途
陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株篩選等。
材料與儀器
儀器：熒光顯微鏡、移液器；
試劑：1×PBS、Tris-HCl 緩沖液、50 mM 氯化銨（用 PBS 配制）、含 1% BSA 的 PBS 溶液（簡(jiǎn)稱封閉液）、細(xì)胞、90% 甘油（用 Tris-HCl 緩沖液配制）、透明指甲油、4% 的多聚甲醛（用 PBS 配制，PH 7.4）、一抗（純化的單克隆抗體或雜交瘤細(xì)胞上清液）、二抗（FITC-抗鼠 IgG+IgM）、Triton X-100；
耗材：Lab-Tek II 腔室載玻片系統(tǒng)或 96 孔板、濾紙、移液槍頭、離心管。
步驟
使用免疫熒光技術(shù)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的步驟如下：
1、在腔室載玻片上或 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞至合適的密度（約 60%~80%），棄去上清液，每個(gè)腔室或培養(yǎng)孔中加入 1×PBS 溶液潤(rùn)洗 2 次。
2、棄去 PBS 溶液，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定細(xì)胞，室溫下孵育 15~30 min。
3、棄去固定液，用含 50 mM 氯化銨的 PBS 溶液潤(rùn)洗細(xì)胞 3 次。
4、棄去氯化銨溶液，用 1×PBS 溶液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次。
5、棄去 PBS 溶液，加入冰上預(yù)冷的含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液，完全浸沒(méi)細(xì)胞。置于 20 ℃ 中孵育 3 min。
6、去除液體，用 1×PBS 溶液潤(rùn)洗細(xì)胞 3 次，每次 5 分鐘。
7、棄去 PBS 溶液，加入含 1% BSA 的 PBS 溶液封閉 30 min。
8、棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的一抗，沒(méi)過(guò)載玻片即可。室溫下濕盒中孵育 1 小時(shí)，或 4 ℃ 孵育過(guò)夜。
9、棄去一抗，用 1×PBS 潤(rùn)洗 3 次，每次 5 分鐘。
10、加入二抗（FITC-抗鼠 IgG+IgM，用封閉液 1:100 稀釋），在室溫下避光孵育 1 小時(shí)。
11、棄去二抗，用 1×PBS 潤(rùn)洗 3 次，每次 5 分鐘。
12、棄去 PBS，加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定尚未被固定的細(xì)胞，室溫下孵育 15~30 min。
13、用蒸餾 H2O 潤(rùn)洗細(xì)胞。
14、若用 96 孔板，直接在顯微鏡下觀察即可，觀察完丟棄即可；若用 Lab-Tek II 腔室載玻片系統(tǒng)，則將載玻片夾在兩片濾紙中間，溫和地吸去多余的水分。
15、在載玻片上滴加一滴含 90% 甘油的 Tris-HCl 溶液，蓋上蓋玻片。在蓋玻片邊緣涂上一層透明指甲油起到密封的作用。
16、在熒光顯微鏡下觀察，觀察完的載玻片可以平放在不透光的玻片盒中，于 4 ℃ 或 20 ℃ 保存。
注意事項(xiàng)
1. Lab-Tek II 腔室載玻片系統(tǒng)相較 96 孔板更為優(yōu)越，在前期實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)腔室彼此分隔，可以同時(shí)檢測(cè)不同的雜交瘤細(xì)胞株，后續(xù)又可以取下隔板，一次操作，搞定所有細(xì)胞株，相較 96 孔板操作更簡(jiǎn)單。
2. 48 孔板相較 96 孔板，重復(fù)效果更好。
3. 在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使用牛血清會(huì)導(dǎo)致熒光背景較高，因此可以用低 Ig 含量的胎牛血清或無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
4. 14 和 15 步選做，通常固定一次即可。
5. 二抗孵育開(kāi)始注意避光，防止熒光猝滅。
6. 清洗時(shí)注意不要使液體直接沖擊樣品，防止樣品脫落或碎裂。
常見(jiàn)問(wèn)題
1. 背景高
解決辦法：
① 在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，將常規(guī)的牛血清換成低 Ig 含量的胎牛血清或無(wú)血清培養(yǎng)基；
② 延長(zhǎng)封閉時(shí)間或增加一抗二抗后的洗滌時(shí)間，保證封閉和洗滌的較為充分，盡量把液體完全棄除。
③ 操作過(guò)程中，速度要快，以免細(xì)胞干掉。
2. 無(wú)熒光
解決辦法：
① 設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，排除抗體失效、錯(cuò)加或漏加的可能；
② 細(xì)胞是否污染。
