elisa 法
簡介
ELISA 法是一種免疫測定技術，利用抗原抗體結合的手段，實現細胞或組織內生物活性物質的檢測和定量。融合后的雜交瘤細胞可以產生大量相同的抗體，而細胞融合是一個隨機的過程。
在已經融合的細胞中，有相當比例的無關細胞的融合體，需進行篩選和克隆化，而這種雜交瘤陽性克隆的篩選中，需對單克隆抗體進行檢測，常用方法有酶聯免疫吸附試驗（ELISA），間接血凝試驗（PHA），放射免疫測定（RIA）、直接和間接熒光抗體技術（DFA、IFA）以及免疫酶斑點試驗等。
原理
首先用抗原或抗體包被于固相載體，加入待測抗體或抗原的標本，再加入酶標記抗體或抗原，生成復合物，加底物顯色，生成有色產物，通過酶標儀檢測吸光值，從而計算出待測物的含量。
用途
陽性雜交瘤篩選。
材料與儀器
1、試劑
包被緩沖液 CBS（0.05M 碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）、封閉液（含 2% BSA 的包被緩沖液 CBS）、PBST（含 0.05% Tween-20 的 PBS（pH 7.4））、抗體稀釋液（含 1% BSA 的 PBS 緩沖液，pH 7.4）、二抗工作液（參照二抗說明書推薦稀釋比配制）、TMB 底物、終止液（0.5M H2SO4）
2、儀器和耗材
移液器和槍頭、酶標板、酶標儀、搖床、1.5/2 mL 離心管、15 ml 離心管、滅菌加樣槽、濾紙
步驟
使用 ELISA 篩選陽性雜交瘤細胞株的步驟如下：
1、抗原用包被緩沖液 CBS 按 1 μg/mL 濃度用作連續 1:2 梯度稀釋，每個稀釋度包被一行（12 孔/行）,100 μl/孔加入酶標板中，覆膜密封（防止水分揮發），4 ℃ 包被過夜（12 h 以上）。
2、棄去板中液體，在濾紙上拍干，每孔加入 150 μL 封閉液，室溫（25 ℃）封閉 2 h 以上。
3、用洗滌液 PBST 洗板 3 次，將待測高免陽性血清和空白陰性血清用抗體稀釋液分別從 1:500 開始做連續 1:2 倍比稀釋，按下圖分布模式加入酶標板，每孔 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h。
4、棄去板中液體，在濾紙上拍干，洗滌液洗板 3 次，每孔加入 100 μl 二抗工作液，37 ℃ 搖床上低速孵育 1 h。
5、棄去板中液體，在濾紙上拍干，洗滌液洗板 3 次，每次 2 分鐘，每孔加入 100 μl 單組份 TMB 底物，室溫搖床上低速孵育 5～20 min（孵育時間取決于顏色變化速度）。
6、每孔加入 50 μl 終止液（0.5M H2SO4）。
7、在酶標儀上讀取 450 nm/630 nm 的吸光度。
標準的結果分布模式如上圖所示： ELISA 酶標板顯色由陰陽性區域第一行第一列孔向外顯均勻放射狀遞減；如果在包被梯度方向上 OD450 過高無梯度，應該繼續降低包被濃度；反之，則增加。同理，如果在免疫血清稀釋度方向上 OD450 過高無梯度，則應繼續加大稀釋度，反之，則減小。
8、最佳包被濃度的確定：
陽性血清區域內某個孔對應的 OD 值與其上/其左孔 OD 值恰好為 2 倍關系且 OD 值不低于 1.2，且此孔對應的陰性血清區域 OD 值與空白對照孔 OD 值無差異，此孔包被的抗原濃度的 2 倍確定為抗原的最佳包被濃度。同理也可以參照此方法確定陽性血清的最佳稀釋倍數。
9、以最佳包被濃度將抗原按照上述方法包被到酶標板同時封閉，將陰性/陽性血清依次倍比稀釋，100 μl 加到酶標板孔（最好做復孔），然后依次加入二抗、底物顯色，讀取 OD 值。
10、陽性細胞株/陽性孔的篩選：
選取陽性值最高的孔予以保留并進行亞克隆，具體該選擇保留多少孔根據項目實際需求決定。
注意事項
1、陽性克隆的篩選應盡早進行。通常在融合后 10 天作第一次檢測，過早容易出現假陽性。
2、陽性克隆的篩選應進行多次，均陽性時才確定為陽性克隆進行擴增。篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。
3、一般在雜交瘤細胞布滿孔底 1/10 面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。
常見問題
1、雜交瘤細胞融合后得不到陽性克隆
可能的原因如下：
（1）動物未免疫成功就進行了融合。
（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。
（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當的二抗等諸多因素。
（4）抗原成份與細胞培養條件中的物質相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結構相同或類似的物質產生了競爭反應。
（5）其它所有能影響 ELISA 等相關篩選手段的因素。
2、陽性克隆轉為陰性
正常情況下，雜交瘤不是絕對穩定的，容易發生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復蘇操作時，更容易發生陽性變為陰性。可通過以下辦法盡量減少陽性變為陰性：
（1）保證細胞處在最佳的生長環境中，適時更換培養基。
（2）不要過于頻繁操作細胞，否則細胞容易出現死亡或者生長形態發生明顯變化。
（3）對于傳代次數較多的細胞株需要經常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株凍存保種。
（4）防止細胞被支原體等微生物污染。
