利用流式篩選陽性雜交瘤細胞
簡介
流式細胞儀基于對熒光標記抗原與抗體亞型結合免疫球蛋白作為篩選指標，能夠全自動、快速、高效地對針對抗原特異性且活的雜交瘤細胞進行篩選。
原理
通過測量單個細胞經適當染色后所發出的散射光和熒光，并將它們定量轉化成電信號，經數字轉換器進行數字化后進行電子存儲后進行分析。
用途
測量細胞的大小、內部顆粒的性狀，檢測細胞表面和胞漿抗原、細胞內 DNA、RNA 含量等。
材料與儀器
儀器：
① 電泳儀
② 96 孔板
③ 細胞電融儀器
④ 流式細胞儀
試劑：
① BALB/c 小鼠
② 小鼠骨髓瘤細胞株 SP2/0
③ 費氏不完全佐劑
④ 費氏完全佐劑
⑤ HAT 培養基添加劑
⑥ 胰蛋白酶溶液和胎牛血清
⑦ CD CHO Medium 培養基
⑧ 融合蛋白純化所用的鎳瓊脂糖凝膠
⑨ 單克隆抗體檢測試劑盒
步驟
1、目標蛋白-His 融合蛋白的表達與純化
構建目標蛋白與 His 標簽融合蛋白表達載體，并將其轉入 CHO 細胞，驗證目標蛋白表達并篩選穩定分泌目標蛋白的細胞系。用含 10% FBS 的 CD CHO Medium 培養基懸浮培養 CHO-目標蛋白細胞。當細胞密度培養至 1×107/mL 時，將細胞懸液離心獲取細胞上清。利用目的蛋白攜帶的 His 標簽，采用鎳瓊脂糖凝膠色譜分離蛋白的方法純化融合蛋白。
2、融合蛋白的 WB 檢測
將純化的融合蛋白與對照蛋白制備樣本后進行 SDS‐PAGE 電泳和電轉，封閉后 4 °C 過夜孵育抗體。0.05% PBST 洗膜后孵育二抗，再次洗膜后利用 ECL 進行顯色。
3、雜交瘤細胞株的構建與培養
將融合蛋白與佐劑乳化后注入小鼠腋窩、背側部皮下免疫小鼠，使其 B 淋巴細胞經抗原提呈作用產生針對目標蛋白的特異免疫反應。免疫分多次進行，首次的蛋白劑量為 40 μg，將融合蛋白溶于 250 μL 生理鹽水并與等體積弗氏完全佐劑乳化。28 d 后進行二次免疫，蛋白劑量為 20 μg，并用弗氏不完全佐劑乳化。
二次免疫 7 d 后，取小鼠眼眶血，保留血清成分。在電融合前 4 d 進行加強免疫，蛋白劑量為 40 μg。利用電融合方法將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞 SP2/0 融合，形成雜交瘤細胞。利用 HAT 培養基篩選融合的雜交瘤細胞。采用間接 ELISA 篩選識別目標蛋白重組蛋白的抗體，利用有限稀釋法克隆雜交瘤細胞株。
4、單克隆抗體檢測
利用 ELISA 原理檢測抗體亞型。將融合蛋白包被于酶標微孔板，過夜后洗板。將雜交瘤細胞上清與板中融合蛋白孵育 2 h，洗板后利用試劑盒顯色。
5、流式鑒定
為了鑒定雜交瘤細胞上清中含有的流式抗體，將融合后的雜交瘤細胞培養于 96 孔板，根據細胞生長情況傳代培養至 6 孔板后收取培養的細胞上清，利用流式細胞術檢測雜交瘤細胞上清是否含有識別目標蛋白的抗體。用胰酶消化培養的融合細胞并制備成細胞懸液，以 5×105 的細胞數量與 200 μL 雜交瘤細胞上清冰上孵育 1 h，PBS 洗滌 3 次。將 APC 偶聯的抗小鼠 IgG 熒光二抗用 PBS 以 1:100 稀釋 ，取 100 μL 與融合蛋白細胞孵育 20 min。PBS 洗滌 3 次，用 300 μL PBS 重懸細胞，上機檢測。
注意事項
1、一定記得對照管的設置（空白、單陽、同型、FMO 管、陰/陽管）。
2、學會圈門以及調節補償。
常見問題
流式原理與操作詳細介紹附件：http://lifetech.ustc.edu.cn/files/detail-377.html
