利用 IHC 法篩選陽性雜交瘤細胞

簡介

免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）是以免疫學的抗原-抗體反應為理論基礎，使用標記的特異性抗體，在細胞組織中檢測和定位抗原（例如蛋白質）的技術。這種方法利用了抗體與抗原之間的特異性結合。在陽性雜交瘤的篩選中，IHC 可以用來確定雜交瘤細胞是否產生了目標抗體。

原理

1、抗體和抗原的特異性結合：抗體是由免疫系統產生的，用來識別和結合特定抗原（通常是外來物質，如病毒或細菌，但也可以是自身的蛋白質）的蛋白質。每種抗體都能特異性地識別并結合到其對應的抗原。IHC 利用了這種特異性結合，通過使用特定的抗體來檢測和定位特定的抗原。

2、抗體的標記和檢測：為了在組織切片中可視化抗原，抗體通常會被標記，例如與熒光分子或酶（如過氧化物酶）結合。當這些標記的抗體結合到其目標抗原時，它們可以通過特定的檢測方法（如熒光顯微鏡、電子顯微鏡或酶底物反應等）被可視化。

3、抗原的定位：通過觀察標記抗體的位置，可以確定抗原在組織或細胞中的位置。

在陽性雜交瘤的篩選中，IHC 可以用來確定雜交瘤細胞是否產生了目標抗體。使用一個針對特定抗體的抗原進行 IHC，如果雜交瘤細胞產生了目標抗體，應該能在 IHC 中看到信號。

用途

1、疾病診斷：IHC 是病理學診斷的重要工具，特別是在腫瘤診斷中。通過檢測特定的蛋白質標記物，可以幫助確定腫瘤的類型和起源。例如，某些類型的乳腺癌細胞會過度表達 HER2 蛋白，這可以通過 IHC 來檢測。

2、研究蛋白質表達和定位：IHC 可以用來研究特定蛋白質在組織或細胞中的表達和定位，這對于理解蛋白質的功能和疾病的機制非常有用。

3、藥物研發：在新藥研發過程中，IHC 可以用來評估藥物對蛋白質表達的影響，或者用來檢測藥物的分布和靶向效果。

4、雜交瘤篩選：在抗體生產中，IHC 可以用來篩選和驗證陽性雜交瘤細胞，這些細胞能夠產生目標抗體。

5、疾病機制研究：IHC 可以用來研究疾病的發生和發展機制，例如，通過檢測炎癥、纖維化或其他病理過程中的特定蛋白質。

材料與儀器

1、組織樣本：動物或人類的組織，通常需要進行固定和包埋（通常是石蠟包埋）以便切片。

2、切片設備：用于將組織樣本切成薄片，通常是微切（片）機。

3、抗原修復溶液：用于恢復在固定和包埋過程中可能被破壞的抗原。

4、阻斷溶液：用于防止非特異性抗體結合。

5、特異性抗體：一抗是特異性結合到目標抗原的抗體，二抗是結合到一抗的抗體，并且通常帶有一個可以檢測的標記以便觀測，如熒光分子或酶。

6、檢測系統：一個熒光顯微鏡（對于熒光標記的抗體），或者一個酶底物系統（對于酶標記的抗體）。

7、染色劑和封片劑：用于增強對比度和保護切片。

8、顯微鏡：用于觀察和分析結果。

步驟

1、 組織制備：首先，需要獲取組織樣本并將其固定，通常是使用 10% 甲醛。然后將固定的組織樣本進行脫水、透明、浸蠟，最后在微切機上切成薄片。

2、脫蠟和水化：將切片放入二甲苯或丙酮中進行脫蠟，然后通過酒精系列梯度進行水化。

3、抗原修復：抗原修復是為了恢復在固定和包埋過程中可能被破壞的抗原。這通常涉及到在酸性或堿性環境中加熱切片。

4、阻斷：為了防止非特異性抗體結合，切片需要進行阻斷處理。這通常是通過將切片浸入含有蛋白質（如牛血清白蛋白）或其他阻斷劑的溶液中完成的。

5、一抗孵育：切片被浸入含有特異性抗體（一抗）的溶液中，這些抗體會結合到目標抗原。孵育的時間和溫度可能會根據抗體的具體要求而變化。

6、洗滌：使用緩沖液（如 PBS 或 TBS）洗滌切片，以去除未結合的一抗。

7、二抗孵育：切片浸入含有二抗的溶液中。二抗是結合到一抗的抗體，并且通常帶有一個可以檢測的標記，如熒光分子或酶。

8、洗滌：再次使用緩沖液洗滌切片，以去除未結合的二抗。

9、檢測：如果二抗帶有熒光標記，那么可以直接在熒光顯微鏡下觀察。如果二抗帶有酶標記（如過氧化物酶），那么需要添加相應的底物，通常會在酶的作用下產生可見的沉淀。

10、對照染色和封片：最后可以使用染色劑（如蘇木精-伊紅）對細胞核進行染色，以增強對比度。然后使用封片液封住。

注意事項

1、組織制備：固定和包埋的過程需要仔細操作，以保持組織的結構和抗原的完整性。固定的時間和方法，以及包埋的材料，都可能影響到抗原的可檢測性。

2、抗原修復：抗原修復的方法（如熱誘導的抗原修復或酶誘導的抗原修復）和條件（如時間和溫度）需要根據抗體的特性和組織類型進行優化。過度的抗原修復可能會破壞抗原結構，而不足的抗原修復也可能會導致抗原被掩蓋，無法被抗體識別。

3、阻斷：阻斷的目的是防止非特異性的抗體結合，需要選擇適當的阻斷劑。常用的阻斷劑包括牛血清白蛋白（BSA）和正常羊血清。阻斷的時間和條件也需要優化。

4、抗體孵育：抗體的稀釋和孵育條件需要進行優化，以確保最佳的信號和最小的背景?？贵w的稀釋通常需要根據抗體的特性和目標抗原的豐度進行試驗確定。孵育的時間和溫度也可能需要優化。

5、洗滌：充分的洗滌步驟可以幫助去除未結合的抗體，減少背景信號。洗滌的次數和時間，以及洗滌液的選擇（如 PBS 或 TBS），都可能影響到結果。

6、檢測和顯像：檢測和顯像步驟需要根據抗體的標記和預期的信號強度進行優化。例如，如果使用熒光標記的抗體，需要選擇適當的熒光濾光片和曝光時間。如果使用酶標記的抗體，需要選擇適當的底物和調試顯色時間。

7、對照：應該包括適當的陽性和陰性對照，以驗證實驗的特異性和敏感性。陽性對照是已知含有目標抗原的樣本，陰性對照是已知不含目標抗原的樣本，或者是省略一抗的樣本。

8. 結果解釋：結果的解釋需要考慮到實驗的限制，以及其他可能影響結果的因素，如組織的處理和切片的質量。對于定量或半定量的分析，可能需要進行適當的統計分析。

常見問題

1、背景過高：這可能是由于非特異性的抗體結合，或者檢測步驟過敏感。可能的解決方案包括優化阻斷步驟，調整抗體的稀釋，或者減少檢測步驟的敏感性。

2、信號過弱或無信號：這可能是由于抗原的豐度過低，或者抗體的質量或稀釋不適當?？赡艿慕鉀Q方案包括優化抗原修復步驟，使用更高質量的抗體，或者增加抗體的濃度。

3、信號不均勻：這可能是由于切片的處理不均勻，或者抗體的孵育不均勻。可能的解決方案包括改進切片的處理和存儲條件，或者確?？贵w在孵育過程中能夠均勻覆蓋切片。

4、結果不可重復：這可能是由于實驗條件的變化，或者抗體的質量不一致?？赡艿慕鉀Q方案包括標準化實驗條件，或者從可靠的供應商購買抗體。

5、結果解釋困難：這可能是由于背景信號的干擾，或者目標抗原在組織中的分布不清楚。可能的解決方案包括使用更特異性的抗體，或者結合其他技術（如基因表達分析）來驗證結果。