小鼠原代腸膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)
原理
參考無血清培養(yǎng)法去除雪旺細(xì)胞培養(yǎng)中成纖維細(xì)胞污染的方法，結(jié)合目前已有的腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)法的報(bào)道，我們對小鼠結(jié)腸膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得了純度較高且活性良好的結(jié)腸肌間神經(jīng)叢腸膠質(zhì)細(xì)胞。
材料與儀器
無菌Hanks 平衡鹽溶液( Hank’s balanced salt solution，HBSS)、無菌 PBS 溶液、05% 胰蛋白酶、DMEM/F12 培養(yǎng)基、及青霉素/鏈霉素（Penicillin/Streptomycin, PS）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、多聚賴氨酸( Poly-L-lysine solution，PLL)
玻璃棒、精細(xì)鑷、70 μm 細(xì)胞過濾器、24 孔板
消化液：BSA（3 mg/mL）和II型膠原酶（1.3 mg/mL）溶于 10mL K-HS 溶液
步驟
（1）新鮮分離的小鼠結(jié)腸組織置于無菌冰冷的 HBSS 溶液中清洗；
（2）將 3～5 cm 結(jié)腸腸管套在玻璃棒上，精細(xì)鑷小心剝離腸神經(jīng)叢，置于無菌冰冷的 HBSS 溶液中；
（3）4 ℃，356g，離心 30s，重復(fù)三次清洗組織；
（4）將組織剪碎，置于加入BSA（0.3 mg/mL）和II型膠原酶（1.3 mg/mL）的預(yù)熱 K-HS 溶液，37℃，消化 60 min；
（5）4℃，356 g，離心 8 min，棄上清；
（6）EP 管中加入 5 mL 0.05% 的胰蛋白酶，37 ℃ 消化 7 min，隨后以等量的培養(yǎng)基（DMEM/F12 培養(yǎng)基，10%FBS，1%PS）終止消化；
（7）離心棄上清，重懸，充分吹打混勻，70 μm 的細(xì)胞過濾器過濾；
（8）離心棄上清，重懸，充分吹打混勻，并接種到多聚賴氨酸包被的24孔板中，將孔板至于 37℃，5% CO2 細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)；
（9）2d 后于顯微鏡下可觀察到 EGC 已貼壁，但上清中可見呈現(xiàn)桿狀且懸浮的肌細(xì)胞以及組織碎片，用無菌的 PBS 清洗 3 次以去除未貼壁細(xì)胞，更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；若見少量肌細(xì)胞貼壁，可采用 0.05% 胰蛋白酶消化 3min 去除肌細(xì)胞，繼而用無菌 PBS 清洗 3 次，再更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
（9）每兩天換液，每周交替使用含血清和無血清培養(yǎng)基去除殘余的成纖維細(xì)胞，以獲得更高純度的腸膠質(zhì)細(xì)胞，用于隨后的免疫組織化學(xué)染色和傳代培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)前所有器械消毒，高壓滅菌，液體無菌過濾；
酶消化液現(xiàn)用現(xiàn)配；
實(shí)驗(yàn)中注意充分消化以保證檢測細(xì)胞量足夠；
用于后續(xù)培養(yǎng)需保證全稱無菌操作；
每兩天換液一次，交替使用含血清和無血清培養(yǎng)基，及時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)。
