小鼠結(jié)腸固有層免疫細(xì)胞分離

原理

流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用廣泛，是免疫表型及功能分析的常見實(shí)驗(yàn)方法。而獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液是流式實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。

本為以小鼠結(jié)腸固有層免疫細(xì)胞分離為例，對(duì)單細(xì)胞懸液的獲取方法進(jìn)行簡(jiǎn)述。

材料與儀器

• 剪刀、鑷子、精細(xì)鑷、黑色硅膠皿

• 無菌培養(yǎng)瓶、70 μm 的細(xì)胞過濾器、50 mL 的離心管

• 預(yù)消化液：5 mL的FBS（5%），1 mL 的 5 M EDTA（invitrogen，AM9260G）（5 mM），稀釋于預(yù)先配制好的 HBSS 中，定容至 100 mL，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配

• 酶消化液：15 g collagenase D，4 mg DNase Ⅰ，0.3 g dispaseⅡ 溶解于 100 mL 預(yù)熱的 HBSS/5% FBS 的溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配

步驟

（1）小鼠處死后迅速取出結(jié)腸，去除腸系膜，將結(jié)腸放置于含有冰冷PBS液的無菌培養(yǎng)皿中，沿腸系膜縱向剪開結(jié)腸，在PBS中劇烈搖晃，清洗結(jié)腸，去除腸腔內(nèi)容物；

（2）將結(jié)腸固定在黑色硅膠皿上，精細(xì)鑷在體視顯微鏡下迅速分離黏膜層；

（3）無菌剪刀將結(jié)腸黏膜組織剪成約 1 mm 的碎片，將剪碎的黏膜組織轉(zhuǎn)移置于預(yù)熱的裝有不含鈣鎂的 HBSS（5% FBS和5 mM EDTA）溶液的無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃，250 rpm，震蕩 20 min，棄掉液體，重復(fù)兩次；

（4）第二次震蕩后，過濾，用濾紙吸去多余的液體（保證去除殘留的EDTA），將結(jié)腸轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 的 EP 管中剪碎；

（5）將黏膜組織碎片轉(zhuǎn)移至含 20 mL 結(jié)腸固有層消化液（1.5 g/L collagenase D，40 mg/L DNase Ⅰ，3 g/L dispaseⅡ 溶解于不含鈣鎂的 HBSS 溶液）的無菌培養(yǎng)瓶中，37 ℃，250 rpm，消化 10-20 min；

（6）充分渦旋，70 μm 的細(xì)胞過濾器過濾，收集上清液至 50 mL 的離心管中，4 ℃，1500 rpm，離心 10 min；

（7）棄上清，將分離的細(xì)胞沉淀重新懸浮在冰不含鈣鎂的 HBSS/FBS 緩沖液中，樣本置于冰上，染色；

（8）用細(xì)胞染色液（cell staining buffer；BD Pharmingen TM）清洗細(xì)胞，4 ℃，2000 rpm，離心 5 min；

（9）根據(jù)細(xì)胞量加入適當(dāng)體積的封閉抗體和熒光抗體，上機(jī)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

• 實(shí)驗(yàn)前所有器械消毒，高壓滅菌，液體無菌過濾；

• 實(shí)驗(yàn)中注意充分消化以保證檢測(cè)細(xì)胞量足夠；

• 多色流式需要注意某些 CD 分子位于跨膜區(qū)，細(xì)胞仍需要固定破膜處理，如 CD68,CD206；

• 用于分選或后續(xù)培養(yǎng)需保證全稱無菌操作。