小鼠骨髓來源中性粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

簡介

相比于人類的中性細(xì)胞從外周血中大量獲取，從血液中分離小鼠中性粒細(xì)胞則難度比較大。通過改善傳統(tǒng)的腹腔注射巰基乙醇技術(shù)，應(yīng)用 Histopaque 1077 和H istopaque 1119 的密度梯度離心可以獲得滿足實(shí)驗(yàn)要求的較高純度中性粒細(xì)胞。

原理

小鼠骨髓相比于腹腔和血液，是一個巨大的中性粒細(xì)胞儲存庫，中性粒細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)中豐度較高的細(xì)胞，參與天然免疫并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫。

用途

骨髓中的中性粒細(xì)胞已被證明可以替代血液中的中性細(xì)胞，用于培養(yǎng)研究。

材料與儀器

【溶液與試劑】

C57BL/6 小鼠、含 10% FBS 的 1640 培養(yǎng)基、75% 酒精、9% 生理鹽水、無菌 PBS、Histopaque 1077、Histopaque 1119

【儀器與耗材】

無菌剪刀、無菌鑷子、70 μm細(xì)胞過濾器、細(xì)胞培養(yǎng)板

步驟

（1）小鼠頸椎脫臼處死，噴灑酒精消毒迅速分離股骨和脛骨，盡可能完全地去除肌肉組織；

（2）將股骨和脛骨收集到預(yù)冷 10% FBS 1640 培養(yǎng)基，在冰上進(jìn)行下游操作；

（3）用無菌 PBS 沖洗三次，9% 的生理鹽水浸泡股骨和脛骨，兩端剪去，暴露骨髓腔；

（4）生理鹽水反復(fù)沖洗骨髓腔，70 μm 細(xì)胞過濾器過濾骨髓沖洗液；

（5）離心，室溫 1200 rpm，5 min，棄上清；

（6）生理鹽水重懸，加入 Histopaque 1077 中；

（7）離心，4℃，2000 rpm，20 min；

（8）棄去上層物質(zhì)，生理鹽水重懸，加入到 Histopaque 1119 中；

（9）離心，4℃，2000 rpm，20 min；

（10）小心吸取中間層液體，生理鹽水重懸稀釋；

（11）輕柔混勻，離心，4℃，1500 rpm，10 min；

（12）棄上清，1640 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)板，CO2 培養(yǎng)箱分離培養(yǎng)。

注意事項

1. 實(shí)驗(yàn)前所有器械消毒，高壓滅菌，液體無菌過濾；

2. 生理鹽水沖洗骨髓腔時，要沖至骨髓腔發(fā)白；

3. 用于后續(xù)培養(yǎng)需保證全程無菌操作；

4. 生理鹽水細(xì)胞重懸液與 Histopaque 1077 的體積比為 1:3，加入時需沿管壁緩慢加入；

5. 生理鹽水細(xì)胞重懸液與 Histopaque 1119 的體積比 1:2，加入時需沿管壁緩慢加入；

6. 云霧狀的中間層液體即為中性粒細(xì)胞所在，吸取液體與加入生理鹽水的體積比為 1:5。