小鼠原代結(jié)腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

原理

原代提取目的細(xì)胞會(huì)混雜著大量的其它細(xì)胞，通過不同生物酶的梯度消化、差速貼壁等能夠得到純度較高的目的細(xì)胞群。膠原酶是一種從細(xì)菌中提取的酶，對(duì)膠原消化作用強(qiáng)，適用于纖維組織及上皮組織的消化，其中膠原酶 I 和分散酶 II 消化結(jié)腸組織時(shí)可以使細(xì)胞間質(zhì)的脯氨酸多肽水解，達(dá)到分散細(xì)胞，而不影響上皮細(xì)胞的效果，采用相差消化法、差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞可獲得純度較高的結(jié)腸上皮細(xì)胞。

材料與儀器

含有雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基、5 g/L 胰蛋白酶，Buffer 溶液（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10mM HEPES），消化液（DMEM 培養(yǎng)基溶解膠原酶 I 濃度為 0.1%，分散酶 II 濃度為 0.3%）

無菌剪刀、無菌鑷子、100 μm 細(xì)胞過濾器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板；

步驟

（1）C57BL/6 小鼠頸椎脫臼處死，噴適量酒精，滴加適量 Buffer 快速分離結(jié)腸；

（2）沿腸系膜剪開，DMEM 培養(yǎng)基清洗去除腸腔內(nèi)容物；

（3）無菌剪刀將結(jié)腸組織剪成 1mm3 左右碎片；

（4）10 mL 0.1% 膠原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化組織，37℃，搖床消化 25 min；

（5）吹打混勻，100 μm 細(xì)胞過濾器過濾，收集上清；

（6）相差消化法、差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞；

（7）加入 1 mL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶完全培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（8）細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶 80-90% 后用 5 g/L 的胰酶消化液消化，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板。

常見問題

1. 實(shí)驗(yàn)前所有器械消毒，高壓滅菌，液體無菌過濾；

2. 酶消化液現(xiàn)用現(xiàn)配；

3. 實(shí)驗(yàn)中注意充分消化以保證檢測(cè)細(xì)胞量足夠；

4. 盡可能充分去除成纖維細(xì)胞；

5. 用于后續(xù)培養(yǎng)需保證全程無菌操作。