組織塊直接培養法（原代細胞培養實驗）

材料與儀器

【動物】 選擇大約一半足孕時間的胚胎，10－13 天齡胚胎含有最大數量的未分化的間質細胞，成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。 每組小鼠胚胎 1 個。

【實驗材料】 每組的超凈臺中有以下物品： ① 50 ml 配制好的 RPMI1640 培養液 1 瓶；8 ml 小牛血清（FCS) 1 瓶；100 ml 0.25% 胰蛋白酶 1 瓶；PBS (-)1 瓶 ；② 100 ml 滅菌燒杯 2 個； ③ 50 ml 離心筒 2 個 ；④ 滅菌培養皿 1 個，細胞培養瓶 1 個；⑤  1 ml ，200 μl 移液器各 1 支；槍頭盒 2 個；無菌玻璃攪拌棒 1 個；⑥ 細胞計數板 1 塊； ⑦ 滅好菌的鑷子 1 把，剪刀 1 把； ⑧ 酒精燈 1 臺；

步驟

1) 胚胎的分離。適用哺乳動物(倉鼠、小鼠和大鼠)

2) 將 1－2 個胚胎轉移至一個小的無菌培養皿中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用 PBS 漂洗。

3) 在無菌狀態下，將絞碎的胚胎轉移于一 50 ml 的無菌離心筒中, 加入 40 ml 0.25％ 的無菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動 。

4) 在溫暖的環境中或置于 37 °C 培養箱中輕輕搖動 15 分鐘。

5) 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細胞的液體轉移至一無菌 50 ml 的離心管中，該管內按照每 10 ml 上清加入 1 ml 小牛血清的比例加入牛血清以滅活，胰蛋白酶。

6) 加人新鮮胰蛋白酶溶液(見前述步驟)于含有殘留未消化組織塊的原來的 50 ml 離心筒中，重復步驟 4 和 5。

7) 離心混合的細胞懸液，1200 r/rain，5 分鐘，棄上清。

8) 用新鮮的無菌 PBS 重懸沉淀的細胞，按步驟 7 再次離心。

9)用 PBS 反復洗滌細胞直至上清清亮為止。

注意事項

a．采用認可的方案處死嚙齒動物。

b．立即在無菌超凈臺內用 70％ 乙醇擦洗整個動物。

c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。

d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養皿上。

e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌 PBS 的 100 ml 燒杯中。

f．漂洗胚胎，去掉 PBS。繼續用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。