用溴脫氧尿苷（BrdU)取代的探針進行紫外交聯

原理

含有胸苷鹵代物如溴脫氧尿苷（BrdU)的DNA比非取代的DNA對紫外線誘導的 交聯更為敏感。本方案中的紫外交聯效率是0.1%?10%，而且在單一復合物中出現1 次以上交聯事件的情況十分罕見。

材料與儀器

含有所研究結合位點的M13單鏈載體
17 bp 的 M13 通用引物 1×和10×限制性內切核酸酶緩沖液 （分別含500μmol L和500 mmol L NaCl） 3000 Ci mmol [α32P] dCTP 50×dNTP BrdU 溶液 0.lmol L 二硫蘇糖醇（DTT)
DEAE 膜(Schleicher &- Schuell NA45) 0.5 mL圓底 螺旋蓋的小瓶（Nunc或相當產品） 水浴鍋 紫外透射儀

步驟

1）將10μL含有高親和性蛋白結合位點的目的序列的單鏈M13載體與等摩爾的17 bp M13通用引物混合。用1×限制性內切核酸酶緩沖液（50 mmol/L NaCl)將終體積調至100μL。90℃加熱5min，在室溫下冷卻過夜。

2) 將下列反應物加入雜交混合物中：

50μL [α32P] dCTP (3000 Ci/mmol)

3.5μL 50× dNTP/BrdU 溶液

1.75μL 0.1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT)

7.5μL 10×限制性內切核酸酶緩沖液（NaCl終濃度50 mmol/L)

7μL H2O

5μL Klenow 酶（25 U)

16℃溫育 90 min。

3) 68℃加熱 10 min 滅活 Klenow 酶。

4) 在合適條件下，用40U限制性內切核酸酶消化，產生20?600 bp的DNA片段。

5) 加乙酸銨至0.3 mol/L，用2倍體積的100%乙醇沉淀DNA，重懸于TE緩沖液中。

6) 在含有0.5μg/mL溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上電泳。用DEAE膜分離所要的DNA片段。

7) 用閃爍計數器檢測BrdU取代的DNA片段的特異活性，并用溴化乙錠點跡定量法估計DNA的濃度。

探針的完整性和功能可用遷移率變動DNA結合分析法進行檢測。

8) 在1.5 mL圓底小瓶中建立下列結合反應：

105cpm均衡標記的探針、經緩沖的含有結合蛋白的提取液、10~20μg DNA 載體如 poly (dl-dC) ? poly (dl-dC)。總體積調至50μL。用塑料薄膜封口，再加封Parafilm膜固定。

9) 將小瓶置于試管架上，用倒置的紫外透射燈（305nm，7000μW/cm2) 在正上方5 cm處照射60 min

10) 在各結合反應管中加入以下反應物：

1μL 0.5 mol/L CaCl2

4μg DNA 酶 I

1U微球菌核酸酶 37℃消化 30 min。

11) 加入等體積的2×SDS樣品緩沖液到反應混合物中，100℃煮沸5min。

12) 在適當濃度的不連續SDS-聚丙烯酰胺凝膠上對樣品進行電泳,包括14C 標記的蛋白質分子質量標記物。

13) 電泳結束后，切去凝膠前沿的染料。

14) 干膠，并且用增感屏放射自顯影1?3天，以觀測交聯的蛋白質。

常見問題

其他所需試劑：25 U大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，乙酸銨，100%乙醇，TE緩沖液，經緩沖的含有DNA結合蛋白的提取液，大分子載體 DNA，如 poly (dl-dC) ? poly (dl-dC)，0.5 mol/L CaCl2，DNA 酶 I (Worthington)，1 U微球菌核酸酶（Worthington)，2×SDS樣品緩沖液，Fluor (Du Pont NEN Enhance 或相當物），14C標記的蛋白質分子質量標記物