人臍動脈平滑肌細胞培養實驗-消化法
原理
運用消化法進行人臍動脈血管平滑肌細胞的培養，并用倒置顯微鏡進行形態學觀察和用免疫組化對培養細胞進行鑒定。
材料與儀器
臍帶
膠原酶消化液 胰蛋白酶 膠原酶 彈性蛋白酶 DMEM
眼科剪 滴管 離心機 培養皿 CO2培養箱
步驟
一、實驗步驟
1. 冰冷無菌D-Hanks'液中漂洗，用眼科剪仔細清除脂肪、包膜、血管等組織，轉入青霉素小瓶中，加入少量無菌D-Hanks'液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片。
2. 用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks'液反復清洗8~10 次。
3. 加入 10 倍體積無菌膠原酶消化液(1 mg/mL)，室溫消化30 min，1000 rpm離心 5 min，棄上清，加1 mg/mL胰蛋白酶 37℃消化 20 min，再次離心5 min，棄上清。
4. 加入胰蛋白酶 37℃消化20 min，再次離心5 min，棄上清。
5. 加膠原酶(1 mg/mL)彈性蛋白酶(0.5 mg/mL) 混合消化液 37℃消化 20 min，再離心5 min，棄消化液。
6. 加混合消化液 37℃消化 20 min，再次離心 5 min，細胞加含 10% FBS的DMEM培養基重懸，轉入培養皿 37℃、5% CO2培養箱中培養即可。
注意事項
1. 必須要在無菌的環境下取材，取材后臍動脈立即置入100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的D-hank's液中。
2. 血管從離體到原代培養的細胞時間盡量要短，以保證細胞能在最快的時間內獲得營養。
3. 細胞培養液的PH在7.2-7.4，寧酸勿堿。因為胎兒臍動脈血管平滑肌細胞對堿性條件下耐受性較差。
4. 在原代培養初期，培養液的含量在3ML以下，最適宜的為1-1.5ML，僅夠保持植塊濕潤即可。
常見問題
1. 稀疏排列的單層細胞處甚至無細胞處，這是平滑肌細胞的特征生長表現。
2. 人動脈血管平滑肌細胞體外培養要求高，細胞經過數次傳代可發生細胞凋亡和退化，造成體外培養成功率很低，運用貼壁法可進行胎兒臍動脈血管平滑肌細胞的體外培養。
參考：姜黔峰 ，商黔惠 ，鞏亮 ，等.人臍動脈平滑肌細胞培養方法的探討，遵義醫學院學報，2005 , 28 (2) :118-119
