人淋巴細胞染色體標本制備

原理

在淋巴母細胞分裂高峰時加入秋水仙素，破壞細胞紡錘體的形成，使細胞停止在分裂中期。然后收集細胞，低滲處理，使細胞脹大，染色體伸展。接著進行固定并除去中期分裂相中殘存的蛋白質，使染色體清晰且分散良好。再結合離心技術去掉紅細胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標本。

材料與儀器

HeLa細胞
640培養液 肝素溶液 秋水仙素 胰蛋白酶 EDTA PHA KCl 甲醇 冰醋酸 Giemsa原液 磷酸緩沖液 生理鹽水
超凈臺 鑷子 離心機 水浴箱 天平 離心管 顯微鏡 載玻片 平皿

步驟

1.  微量全血細胞培養至68小時左右，用1 ml 注射器號針頭向每個5 ml 培養瓶內加2滴秋水仙素溶液。
2.  搖勻后繼續培養3小時，此項操作不需要嚴格無菌。

3.  按時終止培養，用吸管溫和吹打成細胞懸液后，移至10 ml 離心管中。
4.  用天平平衡后以1000 rpm 離心8分鐘，棄大部上清，剩0.5 ml。
5.  再吹打成細胞懸液，加入預熱37℃的 0.075 mol/L 的KCL溶液9 ml，置37℃水浴中低滲處理30分鐘（這期間配制3：1甲醇一冰醋酸固定液）。

6.  向離心管中加入1 ml 固定液預固定。平衡后以1000 rpm 離心8分鐘，同樣剩 0.5 ml 上清。

7.  輕輕將細胞吹成懸液，加5~6 ml 固定液，室溫下固定30分鐘。然后離心，棄上清，重復固定一次。
8.  再離心，留0.1~0.2 ml 上清，吹打成細胞懸液。

9.  吸取1~2滴懸液，在距載片約15 cm 高度滴于預冷的干凈載玻片上，迅速對準細胞吹氣促進染色體分散。

10.  斜放載玻片，在空氣中晾干（此期間配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸緩沖液1：10）。

11.  將標本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分鐘，自來水沖洗，晾干后觀察。

12.  低倍鏡下，制片質量較好的標本上可看到有較多的分裂相，染色體之間分散良好，互不重疊。

13.  油鏡下觀察可見每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結。
14.  分區計數染色體數目并判定性別，或拍照后進行核型分析。