自噬體與線粒體免疫熒光共定位

原理

將自噬體和線粒體特異性蛋白的基因與熒光蛋白基因連接起來構(gòu)成融合基因，導入細胞內(nèi)表達，借助熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡對標記蛋白進行細胞內(nèi)活體跟蹤，可對自噬體和線粒體進行共定位可視化分析。

用途

觀察線粒體自噬的動態(tài)變化。

材料與儀器

細胞、12 孔板

自噬體特異性蛋白 EGFP-LC3

線粒體特異性蛋白 DsRed-mito

無血清培養(yǎng)基、PEI 轉(zhuǎn)染試劑

熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡

步驟

1、鋪板：取對數(shù)生長期的細胞胰酶消化后鋪 12 孔板，鋪板量以次日轉(zhuǎn)染時達到 70~80% 左右為宜。

2、轉(zhuǎn)染：準備兩個 1.5 mL EP 管，分別加入 50 μL 無血清培養(yǎng)基，一管加入適量的 EGFP-LC3 和 DsRed-mito 質(zhì)粒，另外一管加入 3 倍體積的 PEI 轉(zhuǎn)染試劑（DNA 質(zhì)粒量: PEI = 1:3），室溫靜置 5 min 后，將兩個 EP 管里面的液體混合，室溫靜置 15 min 后，將轉(zhuǎn)染后復(fù)合物逐滴緩慢加入到細胞中，4~6 h 后更換為完全培養(yǎng)基。

3、觀察熒光：轉(zhuǎn)染 24 h 后即可在熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察熒光。在同一視野下，分別在藍色激發(fā)光下觀察自噬體綠色熒光 EGFP-LC3 以及在綠色激發(fā)光下觀察線粒體紅色熒光 DsRed-mito。如有需要可以采用 DAPI 染核，在紫外激發(fā)光下觀察細胞核藍色熒光。最后將 Images 進行 Merge，觀察自噬體和線粒體的熒光共定位情況。

注意事項

1、血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響，轉(zhuǎn)染時細胞要采用完全培養(yǎng)基（不含抗生素），并用無血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑。

2、細胞狀態(tài)很關(guān)鍵，細胞復(fù)蘇后的 3 代左右時細胞狀態(tài)最好，盡量不要用傳過多代的細胞。