熒光共振能量轉移（FRET）
原理
作為一種高效的光學「分子尺」，熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是采用物理方法去檢測分子間的相互作用的方法，是指兩個熒光發色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移，即發生能量共振轉移。
FRET 程度與基團質檢的空間距離緊密相關，一般為 7~10 nm 時即可發生 FRET；隨著距離延長，FRET 呈顯著減弱。基團之間 FRET 的效率，可以由 E = 1/1 +（R/R0）exp6 反映，其中 R 表示基團之間的距離，R0 表示福氏半徑，依賴熒光基團發射譜和淬滅基團激發譜的重疊程度，以及基團能量轉移的偶極子的相對方位。
用途
適用于在細胞正常的生理條件下，驗證已知分子間是否存在相互作用，比如細胞內分子間的相互作用、膜蛋白的研究、細胞膜受體蛋白間的相互作用、細胞凋亡的研究、核酸檢測等。
材料與儀器
酶標儀、兩種熒光發色基團、細胞系、質粒載體
步驟
以熒光物質 CFP（供體）-YFP（受體）為例，檢測 AB 蛋白在細胞內的相互作用。
1、細胞轉染：構建質粒載體 CFP-A 和 YFP-B，將檢測的 AB 蛋白分別偶聯上熒光蛋白 CFP 和 YFP，并將兩個質粒共轉染到培養的細胞內；
2、轉染 24 小時后，去除培養基，并用 4％ 的多聚甲醛固定細胞 15 分鐘，用 PBS 洗滌兩次；
3、FRET 圖像采集：確定 FRET 配對的激發波長，藍光被調諧分別用于探測最大和最小的供體和受體信號，其中最大供體信號和最小受體信號對應的波長用于收集雙表達細胞的 FRET 信號。調整激光變化以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP 信號的激發光波長，采集供體和受體圖像，收集 FRET 信號。每個細胞 FRET 檢測重復 3 次，每種轉染至少完成 6 個細胞的 FRET 檢測;
4、FRET 數據處理：對于圖像分析和系數計算，每張圖片要減去背景，去除 FRET 信號中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號；另外受體通路的 FRET 信號需要對供體受體光譜靈敏度的變化進行矯正、對自發熒光和光學噪聲進行矯正；同時利用矯正系數對雙標定細胞進行像素匹配矯正。
注意事項
1. 供體熒光基團和受體熒光基團的空間距離要<10 nm，足夠接近；
2. 供體的發射光譜與受體的接收光譜要有相當的重疊；
3. 能量供體與能量受體的熒光生色團必須以適當的方式排列。
