植物組織中蔗糖酶活力的測定

簡介

了解植物組織中提取蔗糖酶的方法，掌握 Nelson 方法測定蔗糖酶活力的原理。

原理

植物組織中蔗糖酶活力的測定的基本原理是蔗糖酶可將非還原性的蔗糖水解為葡萄糖和果糖，而葡萄糖作為還原糖含有的 自由醛基，在堿性溶液中將 Cu2 +還原, 還原糖本身被氧化成羥酸。碑銅酸試劑與氧化亞銅生 成藍色復合物（碑鋁藍），在 510 nm 波長下吸收峰與還原糖濃度呈正比，從而確定蔗糖酶的活 力，該法測定的范圍為 25?200 昭。

材料與儀器

材料: 植物葉片。

器材：分光光度計，刻度具塞試管，恒溫水浴，移液管。

試劑：

①4 mmol ? L- 1 葡萄糖溶液 20 mL

②4 mmol ? L -1 蔗糖溶液 20 mL

③0. 5 mmol ? L-1 蔗糖溶液 200 mL

④0. 2 mol ? L-1 乙酸緩沖液（pH 4.5）200 mL

Nelson 試劑：

⑤A 試劑：100 mL 溶劑中含 Na2CO3 2.5 g,NaHCO3 2.0 g,Na2SO4 20 g, 酒石酸鉀鈉 20 g。

⑥B 試劑：100 mL 溶劑中含 CuSO. - 5 H2O 15 g, 濃 H2SO4 2 滴。以 A : B=50 : 2 的比例混合即可使用，使用前需在 37 °C 以上溶解，防止溶質析出。

⑦碑鉗酸試劑：100 mL 中含鑰酸鉉 5 g, 濃 H2SO4 4. 2 mL, 碑酸鈉 0. 6 g。

步驟

植物組織中蔗糖酶活力的測定的基本過程可分為如下幾步：

1 . 標準曲線制作：

（1）取 9 支具塞試管，按表 49-1 加樣。

表 49-1 標準曲線制作加樣表 mL

（2）向每管中加 1 mL Nelson 試劑，蓋上塞子，置沸水浴中 20 min。冷至室溫，向每管中加 1 mL 碑鑰酸試劑。

(3)5 min 后，向每管中加 7 mL 蒸饞水，混勻。

(4) 在 510 nmT 測定光密度，以還原糖葡萄糖為橫坐標，以 ODs。響值為縱坐標，制作標 準曲線。

2. 酶活力測定：取 2 g 小麥苗，加入 2 mL 乙酸緩沖液，在冰浴中用研缽研磨成糊狀， 12 000 r- min 1 離心 10 min, 留取上清液用于酶活測定。取 2 支具塞刻度試管，向每個試管 中加入乙酸緩沖液 0.8 mL,0. 5 mmol - 蔗糖溶液 0.2 mL, 適當稀釋的酶液 1 mL, 以同 樣處理但不加酶液者為空白對照，室溫下放置 10 mino 然后向每管中加 1 mL Nelson 試劑， 置沸水浴中 20 min。冷卻至室溫，向每管中加 1 mL 碑鑰酸試劑，5 min 后，向每管中加 7 mL 蒸餡水，510 nmT 比色，測定光密度 OD 沁 nm。

3. 結果計算：在室溫、pH 為 4.5 的條件下，每分鐘水解產生 1 日 mol 葡萄糖所需的酶量定 義為酶的 1 個活力單位 (U)。

蔗糖酶活力 (U?g— 1 . T、測得還原糖含量 XnXVXl 000

5 )— WXt式中：〃一稀釋倍數；

V—酶液的總體積，mL；

W 一樣品重，g；

t 一時間,10 min；

1 000—毫摩爾換算為微摩爾的倍數。

注意事項

1. 酶液的提取過程要盡量在低溫條件下進行。

2. 配制葡萄糖標準液時，葡萄糖應在恒溫干燥箱中 80°C 下干燥至恒重。