植物體內(nèi)甜菜堿含量的測定
簡介
甜菜堿是一種分布很廣的細(xì)胞相容性物質(zhì)，許多植物在鹽漬、干旱脅迫下，細(xì)胞 內(nèi)大量積累甜菜堿，因此甜菜堿可作為植物抗逆性的一項生化指標(biāo)。利用化學(xué)比色法可測定 植物體內(nèi)的甜菜堿含量。本實驗?zāi)康氖钦莆沼没瘜W(xué)比色法測定植物體內(nèi)的甜菜堿的原理和 方法。
原理
植物體內(nèi)甜菜堿含量的測定的基本原理是碘可與四價鉉類化合物 (QACs) 反應(yīng)，形成水不溶性的高碘酸鹽類物質(zhì)，該物質(zhì) 可溶于二氯乙烷，并在 365 nm 波長下具有最大的吸收值。根據(jù)甜菜堿類化合物與膽堿被碘 沉淀所需的 pH 范圍不同，甘氨酸甜菜堿含量等于四價鏤化合物的量減去膽堿的量。
材料與儀器
材料: 新鮮菠菜葉片或其他植物葉片。
器材：紫外分光光度計，離心機(jī),Dowex 1 柱或 Dowex 1 與 Aberlite (1 + 2) 混合柱， Dowex 50 柱。
試劑：
①甲醇
②氯仿
③碘
④碘化鉀
⑤鹽酸
⑥二氯乙烷
⑦KH2PO4
⑧NaOH
⑨甜菜堿提取液以甲醇： 氯仿: 水=12 ： 5 ： 3 的比例配制。
步驟
植物體內(nèi)甜菜堿含量的測定的基本過程可分為如下幾步：
1. 甜菜堿提取和純化：稱取 1?2 g 菠菜葉片加入 10 mL 甜菜堿提取液研磨。勻漿液在 60?70P 水浴中保溫 10 min。冷卻后，于 20 °C 下 1 000 g 離心 10 min, 收集水相。氯仿相再 加 10 mL 提取液，反復(fù)振蕩, 于 20 °C 下 1 000 g 離心 10 min 取上層水相。下層氯仿相加入4 mL 50% 甲醇水溶液，進(jìn)行提取，于 20 °C 下 1 000 g 離心 10 min。將上層水相合并，調(diào) pH 5. 0-7.0, 在 70 °C下蒸干，用 2 mL 水重新溶解。
2. 離子交換法純化：將樣品加入 Dowex 1 柱 (1 cmX5 cm,OH ) 或 Dowex 1 與 Amber lite (1 + 2) 混合柱中，用 5 倍柱體積的水洗柱, 收集流出液。流出液直接加入 Dowex 50(1 cmX5 cm,FT) 柱中，用 5 倍柱體積的水洗脫柱子。甜菜堿類化合物由 4 mol - L'1 氨水洗脫而 得，收集 pH 中性的流出液，于 50?60 °C 下蒸發(fā)除去水分，再用適當(dāng)體積的水溶解。
3. 測定：
(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在 10?400 ? mL'1 范圍內(nèi)分別制作甜菜堿和膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。
甜菜堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制 QACs 沉淀溶液時取 15.7 g 碘與 20 g KI 溶于 100 mL 1 mol - L~undefined HCl 溶液中，過濾，于 4 °C 下保存待用。每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 0. 5 mL 加入 0.2 mL QACs 沉淀溶液混勻，0 °C 下保溫 90 min, 間歇振蕩。加入 2 mL 預(yù)冷水, 迅速加入 20 mL 經(jīng) 10°C 預(yù) 冷的二氯乙烷，在 4 笆下劇烈振蕩 5 min,4°C 下靜置至兩相完全分開?；謴?fù)至室溫，取下相測 其在波長 365 nm 處吸光度值。
膽堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線：同上，但反應(yīng)試劑用膽堿沉淀溶液取代即可。配制膽堿沉淀溶液時，取 15. 7 g 碘與 20 g KI 溶于 100 mL 0. 4 mol ? L_1 KH2PO4-NaOH 緩沖液 (pH 8. 0) 中過濾，濾 液于 4°C 下保存待用。
(2) 樣品測定: 按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法分別測岀四價鉉化合物與膽堿的量。
(3) 實驗結(jié)果：甘氨酸甜菜堿含量為四價鉉化合物的量與膽堿的量之差。
注意事項
被測植株若預(yù)先進(jìn)行滲透脅迫處理，結(jié)果會更顯著。
