正常大鼠原代心肌細胞培養

一、實驗試劑

1、培養基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗滌液： 1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S

4、染色液： 0.4% Trypan Blue

5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、檢測試劑：一抗小鼠抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白，二抗FITC標記山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）

二、實驗器械

1、培養皿

2、培養瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科鑷

5、200目網篩

6、玻璃滴管

7、燒杯

8、15ml離心管

三、實驗流程

取材

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取心肌組織放入D-Hanks中洗滌3次

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剪碎至1mm3 +消化液（PriCells）

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37℃水浴8min，吸棄上層懸液（非心肌細胞）

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余下組織加消化液（PriCells） 37℃磁力攪拌10min，60r/min

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上層懸液加消化終止液（PriCells）

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余下組織再加消化液（PriCells）繼續消化3-5次

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收集所有混懸液過200目網篩

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收集濾液1000RPM/10min

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去上清，收集沉淀，2ml培養基重懸

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染色計數

四、實驗操作

1、培養瓶預包被。試驗前一天預包培養瓶，置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干（切記保持無菌），4℃冰箱放置，備用。

2、取材：出生1—3天幼鼠。

3、材料預處理：將獲取的心臟放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反復洗滌，至心室內無血漬，洗滌液澄清為止。

4、消化：將心室肌用眼科剪剪成1mm3 大小組織塊，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上層混懸液遺棄；余下組織加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力攪拌器攪拌10min；吸取上層混懸液，終止反應；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊完全消化。

5、終止消化：按1∶1加入消化終止液，中止酶反應。

6、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中，1000 rpm，離心10 min，棄去上清，加入培養液重懸，染色計數細胞。

7、培養細胞密度：調整細胞密度以5 × 105 個/ml 接種入培養瓶。

8、培養：放置于37℃，5% CO2 培養箱中。

五、細胞鑒定

1、顯微鑒定：接種后12h細胞形態變為梭形或不規則扁平狀，24h后即可看到單個細胞的自發收縮，繼而細胞逐漸鋪展伸出偽足，形成不規則的星形，到第3～4天，細胞相互接觸交織成網，形成細胞單層或細胞簇。

2、免疫組織化學鑒定：利用α-橫紋肌肌動蛋白抗原檢測。

3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養板中，接種細胞為3×104 個/孔，48小時候細胞可以長滿，用鑷子取出鋪滿細胞的蓋玻片備用。

4、細胞固定：用PBS洗滌細胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定10min，空氣中自然干燥。

5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置4℃孵育過夜。

6、洗滌：1×PBS（pH 7.4）洗滌3次×15分鐘，晾干。

7、標記性抗體：加入熒光標記抗體，37℃孵育1h。

洗滌：1×PBS（pH 7.4）洗滌3次×15分鐘，晾干。

8、封片：封片劑封片。

9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，可見胞漿呈棕黃色染色，表明細胞對α-橫紋肌肌動蛋白的表達呈陽性。

六、注意事項

1、選用出生1-3d的幼鼠。

2、在取出心臟之前給實驗鼠進行消毒處理。

3、采用多次消化，直到組織塊完全消化，減少消化液對細胞的損傷。

4、由于心肌細胞只占總細胞的25%，在接種心肌細胞之前做差速貼壁，除掉大部分成纖維細胞。

5、初分離獲得的心肌細胞在生理濃度的鈣離子溶液中易喪失收縮活性, 為了保持心肌細胞的收縮功能, 在分離的過程中應采用4℃的無鈣離子Hanks＇緩沖液浸泡和沖洗心肌組織。

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