大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的問題及對策
動物細胞培養(yǎng)開始于本世紀初，到1962年規(guī)模開始擴大，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。由于動物細胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特性、相關(guān)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和質(zhì)量以及一致性要求，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)仍難于滿足具有重要醫(yī)用價值生物制品的規(guī)模生產(chǎn)的需求，迫切需要進一步研究和發(fā)展細胞培養(yǎng)工藝。目前，世界眾多研究領(lǐng)域集中在優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。
細胞培養(yǎng)環(huán)境
細胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細胞密度的主要限制因素。體外動物細胞培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細胞生長的主要因素之一。氨的積聚使細胞內(nèi)UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影響細胞的生長及蛋白的糖基化過程。氨抑制Gln代謝途徑，使Asp和Glu消耗增加。細胞消耗Asp增加，可能是細胞線粒體膜上蘋果酸－天冬氨酸泵轉(zhuǎn)運NADH加快，使細胞維持糖酵解途徑的需要。Asp消耗增加可能會從Gln代謝多經(jīng)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶途徑而不是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或谷氨酸脫氫酶途徑得以補償。
氨來源于兩方面：一是直接來源于培養(yǎng)基，一是細胞代謝所產(chǎn)生。但兩者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培養(yǎng)基中Gln自然分解，限制Gln用量，并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。
乳酸是細胞糖代謝的產(chǎn)物。高濃度乳酸會抑制乳酸脫氫酶(LDH），從而減少乳酸產(chǎn)生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶聯(lián)的丙酮酸/乳酸轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也導(dǎo)致低濃度丙酮酸，從而導(dǎo)致Gln消耗減少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量產(chǎn)生減少，更多的能量用于維持離子濃度梯度，因此高乳酸濃度必將抑制細胞生長。
氨和乳酸對細胞的毒性作用已在多種不同的細胞系有大量報道，不同細胞系對于這兩種代謝產(chǎn)物的耐受性差別很大，原因可能是不同細胞系葡萄糖和谷氨酰胺代謝過程中關(guān)鍵酶的敏感性不同，或者在不良生長環(huán)境下，細胞轉(zhuǎn)換代謝途徑，特別是氨基酸代謝的改變。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，因此降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生的同時，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。這些代謝改變機理的研究將有利于設(shè)計適當?shù)目刂品桨浮?/span>
隨著細胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大，由于二氧化碳的產(chǎn)生速率比通過換氣從培養(yǎng)基中去除二氧化碳快因而導(dǎo)致CO2積聚，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細胞代謝水平。CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中，最適CO2水平為4%～10％。當達到14％時便會阻礙細胞生長。在一定的pH條件下，CO2分壓升高會使培養(yǎng)基滲透壓升高。常規(guī)/高滲透壓條件下，高CO2分壓使重組CHO細胞系的生長和組織型纖溶酶原激活劑(tPA)產(chǎn)率均受到抑制。
當CO2分壓升高時，tPA糖鏈中包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的唾液酸比例稍下降，但tPA的總唾液酸含量、其他單糖含量、tPA的I型II型相對含量、表面電荷分布和高－甘露糖單糖比例等影響產(chǎn)品質(zhì)量及一致性的因素在高CO2條件下也沒有改變。這表明CHO細胞生產(chǎn)tPA具有很強糖基化能力。盡管如此，控制通氣參數(shù)，平衡氧的輸送及CO2的去除，防止生物反應(yīng)器運轉(zhuǎn)中CO2積聚仍是明智選擇。
甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代謝產(chǎn)物，也是脂類、氨基酸代謝的產(chǎn)物，對于細胞有潛在的損傷作用。MG能改變氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。細胞內(nèi)MG的水平由乙二醛縮酶和還原酶兩種酶的活性來平衡，代謝途徑是糖酵解途徑。
葡萄糖濃度很高(100mM)時，細胞內(nèi)MG幾乎是正常培養(yǎng)條件下的兩倍。增加培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度也會引起MG中度增加。用腐敗假單胞菌乙二醛縮酶基因轉(zhuǎn)染的CHO細胞中乙二醛縮酶活性增長至三倍多，MG濃度比野生型CHO低。
然而，MG濃度降低的細胞與在典型生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的細胞的生長活力有何不同尚未確定。通過批次培養(yǎng)中限制葡萄糖用量來降低葡萄糖消耗，由此來確定降低糖酵解代謝是否導(dǎo)致細胞內(nèi)MG濃度降低，從而最終確定MG濃度降低是否提高培養(yǎng)活力或影響產(chǎn)品特性的研究具有重要意義。另外，培養(yǎng)基中加入胎牛血清可降低MG濃度。
不管用NaCl、KCl還是蔗糖升高滲透壓，均可增加批次培養(yǎng)中抗體濃度。細胞系間產(chǎn)率增加幅度不一，對骨髓瘤細胞影響較小。高滲透壓不僅影響細胞批次培養(yǎng)中抗體或tPA產(chǎn)量，而且影響細胞生長速度、對數(shù)生長期的長短、細胞死亡的速度。由于細胞生長環(huán)境不斷變化，有關(guān)滲透壓影響的量化進展不大。然而，在大約400mOsm的范圍內(nèi)，細胞雖然生長減慢，但特定抗體產(chǎn)生增多，細胞濃度增大導(dǎo)致最終高產(chǎn)品濃度。
另外，在培養(yǎng)基中加入諸如甘氨酸甜菜堿、三甲基甘氨酸或脯氨酸等滲透壓保護劑在一定程度上減輕了高滲透壓對細胞的生長抑制作用，但不影響細胞表達目的蛋白質(zhì)的水平，同時可使細胞較長時間的維持高水平表達。
多孔微載體的研制替代了容易使細胞受機械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。為創(chuàng)造更大優(yōu)勢，多孔微載體內(nèi)部保護空間必須保證細胞能夠進入生長。對于有些細胞株盡管能貼在微載體內(nèi)，但“移動性”很差，因此需要發(fā)明一種更好的培養(yǎng)方式，提高微孔的開放性或者改善其表面特性，從而提高細胞貼壁率同時增加細胞移動性。
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