常用原代動物細胞培養——肝星狀細胞培養

材料

相差顯微鏡，熒光顯微鏡，手術器械，雄性SD大鼠，體重250-450 g，戊巴比妥鈉，200目尼龍網，小牛血清（或胎牛血清，則更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D-Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L），HBSS，臺盼蘭等。

方法

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->門靜脈插管-->D-Hanks'液灌注，同時剪開下腔靜脈-->灌以胰酶消化液-->離體肝臟并剪碎-->繼續消化-->以尼龍網過濾-->450 g X 5'（4度，下同）-->ppt以HBSS重懸-->混以Nycodenz液-->轉至離心管，并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面細胞-->重懸、離心收集細胞-->細胞計數，并判斷存活率和產量-->按照常規接種-->次日換液。

傳代方法：棄培液-->以D-Hanks'液洗兩次-->0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->鏡下觀察細胞突起回縮（2-5分鐘左右）-->以完全培液（DMEM+10% NBS）終止反應（若不用EDTA，可以不需離心）-->吹打，1:2-1:3接種，然后繼續培養（5% CO2，37度）。

結果

次日，光鏡下可見細胞呈星芒狀，胞質內有脂滴，熒光鏡下328 nm處見自發熒光。附上本人發表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片（見插圖）。

討論

進一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和alpha-SMA；后者在細胞激活后才表達。也采用過無須原位消化的方案，完全可行，只不過消化時間更難控制！

參考文獻

袁桃霞，張錦生，張月娥，等. 大鼠肝Ito細胞的體外培養及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫科大學學報 1996;23(2):90-93.

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