正常人表皮朗格漢斯細胞的培養

實驗材料：

1. 多來自外科手術的臨床病人或死亡時間不超過24h尸體的胸、腹部皮膚；

2. 不含Ca2+和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 培養用液：

①RPMI1640完全培養液，由RPMI1640培養基添加10%人AB血清、2mol/L谷氨酰胺、50μg/ml慶大霉素和1μg/ml消炎痛；

②D-Hanks平衡鹽溶液：無Ca2+ 和Mg2+ ，添加慶大霉素50μg/ml；

③消化液：為胰蛋白酶溶液，終濃度為0.05%。貯存液濃度為0.25%，分裝，-20℃下保存；

④臺盼藍染液：濃度為0.16%溶于PBS中，過濾除菌，分裝保存（-20℃）；

⑤淋巴細胞分離液（密度為1.077g/cm3）：臨用時以雙蒸水稀釋，1.6ml的雙蒸水加3.4ml的淋巴細胞分離液；

⑥人基因重組的GM-CSF：濃度為200U/ml；

4. 培養器具：包括金屬手術器械如外科手術刀、組織剪、彎剪及眼科直、彎鑷等。此外，還有皮片制備器械如軟木板、消毒紗布、分離針頭、培養皿、削皮片和刀片等。所有用品均消毒后備用；

表皮細胞懸液的制備：

1．用外科手術刀將皮下脂肪除去，并將皮膚切成一定大小的皮片（不超過100cm2 ）。浸入20ml的D-Hanks平衡鹽溶液中30min；

2．在軟木板上覆蓋消毒紗布，并用大頭針將皮片固定其上。注意將皮片繃緊十分有利于皮片的制備；

3．抹干皮膚上液體，用備皮刀片取皮片。皮片厚大約0.15mm左右，由表皮和乳頭層組成，可根據需要調節片皮的刀片角度以制備出合格的皮片；

4．將皮片的真皮層朝下放入預冷的胰蛋白酶溶液中，于37℃下作用1h，或在4℃下過夜；

5. 向上述被消化的皮片中加入10ml含10%胎牛血清的D-Hanks平衡鹽溶液，終止胰蛋白酶溶液的消化作用；

6. 取出一個皮片，用注射用針頭或眼科用剪子細將表皮與真皮剝離。如表皮與真皮較易分離，說明胰蛋白酶作用時間長短適宜

7. 將表皮移入另一培養皿，加入少許胎牛血清，用彎剪將皮片剪碎，并用吸管不斷吹打；

8. 用消毒紗布過濾懸液，去除殘余團塊、碎片和角化層；

9. 以含10%胎牛血清的D-Hanks平衡鹽溶液離心洗滌過濾液（1000r/min,10min）；

朗格漢斯細胞的富集：

1. 首先將細胞密度調節至5×106 個/cm2 ；

2. 以2:1的比例在15ml離心管中分別加入細胞懸液與淋巴細胞分離液，以1500r/min離心20min；

3. 收集分界面上低密度組分，加入另一15ml離心管中。再用含10%胎牛血清的D-Hanks平衡鹽溶液離心洗滌2次（各1000r/min，5min）；

4. 細胞計數，并在相差顯微鏡下估計朗格漢斯細胞的數量百分比。朗格漢斯細胞數量百分比低，可重復上述步驟，對朗格漢斯細胞進一步富集；

朗格漢斯細胞的短期培養：

1． 將經過上述富集過程的朗格漢斯細胞以5×105個/ml的細胞密度或部分富集表皮細胞以106 個/ml密度種植，加入ROMI1640培養液（添加GM-CSF 200U/ml）；

2． 細胞培養24h后，收集未貼壁細胞，貼壁基本上全部為朗格漢斯細胞；

3． 可重復上述朗格漢斯細胞富集過程，以去除死細胞和殘余的角質形成細胞；

4． 繼續培養48—72h；

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