細胞實驗技術及基本知識（二）

個別組織細胞的培養

體內組織細胞在體外培養時，所需培養環境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術措施亦不盡相同，現介紹個別組織細胞培養的要點如下:

一、上皮細胞培養

上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細胞，培養時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養關鍵。

體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產流產兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。

2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。

3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。

6、反復吹打，制成懸液。

7、培養：用80目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。

二、內皮細胞培養

內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究內皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。

研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：

1、產后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養，可于12小時內保存于4℃。

2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。

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