細(xì)胞培養(yǎng)的一些問(wèn)題

1、液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？

要冷藏！因?yàn)橐后w培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時(shí)，其溶液的pH值會(huì)發(fā)生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會(huì)受到影響對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月～一年。

2、液體培養(yǎng)基中谷氨酰胺的作用，及使用方法

幾乎所有的細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20 ?C冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。

加有谷氨酰胺的液體培養(yǎng)基4℃ 冰箱儲(chǔ)存兩周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心在其服務(wù)項(xiàng)目中配制分裝了高濃度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培養(yǎng)基中，其終濃度為2mM/ml培養(yǎng)基。包裝為粉紅色，-24℃保存。

3、培養(yǎng)用液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2～7.4，偏離此范圍對(duì)細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不完全相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng)。

但總體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些，偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，我們?cè)谂渲婆囵B(yǎng)用液時(shí)，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過(guò)0.10um或0.22um濾膜過(guò)濾時(shí)，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。

4、常用培養(yǎng)基及培養(yǎng)用液的滲透壓范圍

培養(yǎng)基名稱 滲透壓范圍（mOSM）

DMEM（高糖） 315～350

DMEM（低糖） 270 ～330

RPMI-1640 260～290

MEM-EBSS 280～310

MEM-NEAA 280～310

McCoy5a 280～310

MEM-a 280～310

M—199 275～305

IMDM 270～300

DMEM/F-12 280～310

F—10 270～300

F—12 275～300

培養(yǎng)基名稱 滲透壓范圍（mOSM）

L—15 280～320

D-Hanks 280～300

Hanks 280～300

PBS 275～300

5、細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶濃度越高越好嗎？

不見(jiàn)得！因?yàn)橐鹊鞍酌溉芤旱南芰κ呛腿芤旱膒H、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++， Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0， 溫度37 ℃其作用能力最強(qiáng)。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。

我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hank's液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液濃度為：

（1）0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

（2）0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA。

（3）0.25%胰蛋白酶。

溶液pH8.0～9.0，使用D-Hank's液配制。

多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA這種消化液。

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