正常兔肺泡巨噬細胞的培養

實驗材料：

1. 肺泡巨噬細胞來源：體重為2—3kg的成年兔。也可使用成年大鼠；

2. 灌洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.4；

3. 培養液：MEM培養液，添加谷氨酰胺1mmol/L、卡那霉素100μg/ml、青霉素200IU/ml、鏈霉素200μg/ml、HEPES 10mmol/L和10%胎牛血清；

4. 無菌手術器械：手術刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗等；

實驗方法：

1. 通過耳緣靜脈給兔子快速注射約40ml空氣致死；

2. 打開胸腔，暴露出氣管的上段并分離四周的組織。用動脈鉗夾緊氣管，阻塞氣管腔，防止血液由此進入肺。在氣管結扎點的上端橫切氣管；

3. 將氣管、肺和心臟整體移出胸腔。細心分離切除心臟。注意切勿損傷肺、氣管及支氣管、排除肺循環中的血液。用預溫的生理鹽水清洗肺表面，盡量洗凈血液；

4. 用紗布輕輕抹干肺表面液體。用另一動脈鉗牢固地夾住氣管壁（注意不要堵塞氣管腔），將肺懸掛在合適的支持物上；

5. 取下夾住氣管腔的鉗子。將預溫至37℃的灌洗液30—40ml慢慢灌入氣管，直到肺臟擴張。再夾緊氣管，輕輕按摩肺臟；

6. 松開氣管，將肺灌洗液倒入一個預冷的燒杯中。密封后暫存于4℃冰箱內；

7. 重復步驟5和步驟6

8. 混合2次取得的灌洗液。在4℃條件下離心（500g，5min）。用小口徑毛細吸管小心吸棄細胞團與上清液之間的絮狀物（主要為細胞碎片和粘液），再吸棄上清液；

9. 加入培養液，用吸管反復吹打，將細胞團制成細胞懸液。按常規法計數細胞。從每只正常兔的肺灌洗液中可獲得大約2×107 個細胞。

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