小鼠成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

原代培養(yǎng)

1.取新生3d以內(nèi)BALB/c小鼠，斷頸處死后立即投入75%酒精中消毒5min（雖有頭部皮膚保護(hù)，但時(shí)間不要過長(zhǎng)，所以事先要把準(zhǔn)備工作做好之后再去殺老鼠）。

2.D-Hank’s液漂洗后分離顱蓋骨，刮除骨膜和結(jié)締組織，DMEM清洗顱骨骨片并剪碎。（自我感覺碎一點(diǎn)好一些）

3.加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37°恒溫消化20min，吸出消化液，之后1mg/1mlI型膠原酶37°恒溫消化20min后離心（1000r/min，5min），棄上清液。（消化時(shí)間自己摸索，之前我消化30分鐘，但最后發(fā)現(xiàn)消化30min后懸浮未貼壁細(xì)胞較多，于是降低了胰酶消化時(shí)間，增加了膠原酶消化時(shí)間），

4.加入含15%血清的DMEN培養(yǎng)基，吹打骨片（力氣不要過大，但要吹打次數(shù)多一下，盡量使細(xì)胞從松解得骨片上脫落），將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃ CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)

1.棄除舊的培養(yǎng)液（可以吸，可以倒，倒的時(shí)候小心）

2.用PBS沖洗一遍（加PBS清洗或換液時(shí)，主要反拿培養(yǎng)瓶加液，不要將細(xì)胞沖刷下來）

3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在顯微鏡下觀察，細(xì)部變圓，間距增大時(shí)，可用手拍打瓶側(cè)壁與底壁，會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞很快懸浮（如果拍打的話，下一步注意千萬不要棄去消化液，如果不拍打，可以棄去）

4.加入含15%的牛血清培養(yǎng)液終止消化

5.用吸管反復(fù)細(xì)心吹打瓶底，置離心管中后，可以用PBS或D-HANKS再吹打，可以反復(fù)幾次，目的是將細(xì)胞盡可能的洗刷干凈（用PBS或D-HANKS目的是省錢，呵呵培養(yǎng)基也可以，不過money多，而且易產(chǎn)生氣泡）

6.離心

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