造血細胞集落形成實驗

原理

用瓊脂或甲基纖維素混懸骨髓細胞，然后將細胞接種于培養皿，加入合適的生長因子。

材料與儀器

骨髓細胞 甲基纖維素 Noble瓊脂 FBS 生長因子 10%BSA Wehi-CM
Alpha培養基 Petri培養皿 水浴箱 培養箱

步驟

甲基纖維素液的配制：
(a)稱 7.2 g 甲基纖維素，放入盛有 1 個較大磁棒的 500 ml 瓶；
(b)將甲基纖維素高壓滅菌；
(c)加入 400 ml 加熱至 90℃的無菌超純水，將甲基纖維素弄濕；
(d)在 4℃ 條件下，攪拌過夜，使甲基纖維素溶解，得到 2x 甲基纖維素。用不帶針頭的注射器分裝甲基纖維素比吸管更精確。
Alpha 培養液的儲存液配制：
(a)粉末狀 Alpha 培養基（GIBCO，10 L 包裝量）；
(b)100 ml 100xMEM 維生素儲存液；
(c)200 mg 硫酸慶大霉素。
在加熱的攪拌器上攪拌培養液，直至培養基溶解。溫度不要超過37℃ 。然后，加入超純水，制成3 L 。在用孔徑為 0.22 um 的濾器進行最終過濾之前，最好先后用孔徑為 5 um 、1.2 um、0.8 um 和 0.45 um 的濾器過濾。分裝成 21 ml，在 -20℃ 條件下儲藏。
2xAlpha 培養液的配制：
(a)21 ml Alpha 培養液的儲存液；
(b)25 ml 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）；
(c)1 ml 谷氨酰胺（200 mmol/L）；
(d)3 ml 7.5% 碳酸氫鈉。
將上述成分放入無菌瓶，混合，平衡至 37℃。

一、BFU-E、CFC-mix 和 CFU-GEMM 的培養
1. 將添加 BSA 的 2xAlpha 培養液和等量的 2x甲基纖維素混合，制成實驗需要的培養液。將混合液保持在冷的狀態。當處于冷狀態時，甲基纖維索較稀薄。
2. 準備細胞一式三份，但需準備用于 4 個培養皿那么多的混合培養液。由于甲基纖維素粘于試管壁上，常會丟失一些。
3. 將需要濃度的生長因子加入試管內。

4. 加入 5x104 個細胞。
5. 加入 1x培養液，使總量至 4.4 ml。將試管放在旋渦混合器上，混合。
6. 用注射器將 1 ml 細胞懸液注入 3 cm 非培養級培養皿。
7. 在 37℃ 以及 10% CO2 和 5% O2 的濕潤氣體條件下，將細胞培養 8~15 d。

克隆鑒定
BFU-E 集落可以是由很小的細胞構成的單一集落，也可以是多中心集落（像炸彈爆炸），每個集落有緊密排列的很小的淡紅色細胞或紅色細胞。這些集落的發生率為 40~80 個/105 個骨髓細胞。
CFC-mix 集落是單一而密集的集落，通常有細胞光環，細胞體積差別較大。集落可以是多中心的，但細胞顯然是多源性的。CFC-mix 集落發生率為 100~180 個/105 個骨髓細胞，其中約 10 % 集落為含有紅細胞系細胞的混合性集落。如果紅細胞系細胞不是紅色，對于無經驗者來說很難準確鑒定這些集落。應當對集落進行攝影后取出細胞，然后離心，以便固定細胞和用 10% Giemsa 染色。通過鑒定細胞，幫助確認集落。

二、GM-CFC 的培養
1. 使用 30 mm Petri 培養皿（非培養級）。準備培養皿，并進行標記。
2. 配制 0.3 % 瓊脂培養液，在 37℃ 條件下放置。
3. 準備骨髓細胞。用美藍染色后計數有核細胞，或者用 Zapo-globin （Beckman Coulter）溶解細胞后再用電子細胞計數儀計數細胞核。
從每塊股骨獲得 1.0x107~1.5x107 個細胞。
4. 向每個培養皿加入 0.1 ng/ml rMurGM-CSF。
5. 加入 1 ml 含有 7.5x104 個細胞的瓊脂培養液。然后，輕輕搖足，使細胞和瓊脂混合。在室溫條件下，讓瓊脂下沉。
6. 另外，可用 0.8 % 甲基纖維素培養液。用甲基纖維素培養液培養時，一般產生較緊密的集落。這種集落易于計數。
7. 將培養皿放入 1 個清潔的塑料盒內。
8. 將塑料盒放入濕潤的培養箱內，在 37℃ 和 5 % O2 的條件下培養 6 d。
9. 用倒置顯微鏡計數含有 50 個細胞的集落，以 105 個種植細胞中的集落數表示。
10. 正常骨髓 GM-CFC 的發生率為 100~120 個/105 個骨髄細胞。