葡糖氧化酶法測血糖濃度
【實驗目的】
1. 熟悉定量的基本操作，練習使用定量的計量 儀器 。
2. 掌握分光光度計的使用。
3. 掌握比色法原理。
4. 掌握葡萄糖氧化酶法測定血糖的原理和方法。
【實驗原理】
（一）比色分析法
比色分析法是通過比較有色物質溶液顏色的深淺，來測定該物質濃度的方法。有些被檢測的物質溶液本身就具有顏色，而有些物質雖不具有顏色，但可于試樣中加入某種適宜的試劑，使其產生有色化合物。溶液顏色的深淺與試樣中該化學成分的含量成正比。借助于光電比色計和分光光度計，將未知含量的有色溶液和已知含量的有色溶液進行比色，通過計算就可求出未知溶液的含量。
其基本原理根據Lambert定律和Beer定律，比色分析法的計算公式亦由此二定律推衍而得。
Lambert定律 ：一束單色光線通過一有色溶液后，由于溶液吸收了一部分光，所以光線的強度就要減弱。當溶液濃度（C）不變時，光透過的液層越厚，則光線的減弱就越顯著。
若 I 0 =光線通過溶液前的強度（入射光強度）；
I =光線通過溶液后的強度（透過光強度）；
L =溶液的厚度；
而 I/I 0 =表示光線透過溶液的程度，稱為透光度，用 T 表示。則 T = I/I 0 。
Lambert定律證明，- lg I/I 0 ∝ L ，即-lg T ∝ L
寫成等式為- lg I/I 0 = K 1 L/>
-lg I/I 0 = lg I 0 /I ,故上式可寫成lg I/I 0 = KL
令lg I 0 /I為吸光度（ A ）,或稱為消光度（ E ），或稱光密度（ OD 或 D ），所以
A= K 1 L/> ……………………………………………(1)
由（1）式可知，當溶液的濃度不變，溶液的吸光度（ A ）與溶液液層的厚度成正比，這就是Lambert定律。
上式中的 K 1 為常數，其數值與入射光的波長、溶液的濃度及性質有關。
Beer定律：一束單色光通過一有色溶液后，若溶液的厚度不變，其透過光的強度與溶液的濃度（C）有關，溶液的濃度越大，則透過光的強度越弱，他們的關系為：
- lg I/I 0 ∝C，-lg I/I 0 = -lg T = lg I 0 /I =A
故A∝C，寫成等式為
A= K 2 C/>………………………………………………(2)
K 2 亦是常數，其數值隨入射光的波長和溶液的性質而改變。
合并上述（1）（2）兩式，得
A=KCL………………………………………………(3)
這就是Lambert-Beer定律，即溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。
在比色分析中，在相同條件下對兩個性質相同而濃度不同的溶液進行測定，一個為已知濃度的標準溶液，一個為未知濃度的溶液。
設：C 1 為標準溶液的濃度；
C 2 為未知溶液的濃度；
A 1 為測得的標準液的濃度；
A 2 為測得的未知液的濃度。
按（3）式，則
A 1 = K C 1 L /> ; A 2 = K C 2 L /> 2
移項得 A 1 /C 1 = KL 1 A/> 2 /C 2 = KL 2
在使用光電比色計或分光光度計時，溶液放在固定的比色杯中進行比色，故 L 1 = L 2 ，又因為是同一溶液， K 值相同，上兩式的左式相等，故
A 1 /C 1 =A 2 /C 2
移項得
C 2 =A 1 /A 2 ×C 1 …… ……………………………… (4)
(4)式是比色分析中常用的重要公式，只要再乘以樣品的稀釋倍數，就可求得該物質的含量。在以后的實驗中要經常用到它，須牢記。
（二） 721 型分光光度計的使用方法
1. 使用前應檢查 儀器 各部件是否正常，各旋鈕應位于起始位置。
2. 檢查電源電壓是否與儀器要求相符。
3. 接通電源，打開比色槽暗箱，調節0電位鈕，使電表指針位于透光度（ T ）于0處，預熱10min。
4. 旋動波長選擇鈕，選擇適當波長。用靈敏選擇鈕選擇相應的放大靈敏度（靈敏選擇鈕先調1檔，如調不到0，則再逐步增加高檔）。
5. 取3只比色杯，分別裝入空白液，標準液和測定液，依次放比色槽內。
6. 蓋上比色槽蓋，將空白管置于光路上，調節100電位鈕，使指針指到透光度100處。
7. 打開比色蓋，將指針回到0位，再蓋上比色槽蓋看指針是否到100處。如調節好后，0電位鈕和100電位鈕就不可再隨意轉動。
8. 拉動比色杯拉桿，依次將標準液和測定液對準光路，分別讀出吸光度數。
9. 使用完畢后，將0電位鈕和100電位鈕恢復到起始位，切斷電源。
10. 清洗比色杯，倒置于濾紙上晾干，以供下次使用。
（三）葡糖氧化酶法測血糖濃度
血液中的葡萄糖稱為血糖，是糖在體內的運輸形式。血糖濃度受神經系統和激素的調節而保持相對穩定，當這些調節失去原有的相對平衡時則出現高血糖和低血糖。糖尿病、顱內壓增加、脫水癥等均可引起高血糖，飯后、精神緊張可出現生理性高血糖。胰島β細胞增生或瘤癌等，垂體、腎上腺皮質、甲狀腺功能減退，以及嚴重肝病患者均可出現低血糖癥狀。饑餓和劇烈運動可引起暫時的低血糖。
葡萄糖可由葡糖氧化酶氧化成葡糖酸及過氧化氫，后者在過氧化氫酶的作用下，能與苯酚及4-氨基安替比林作用產生紅色醌化合物。醌的生成量與葡萄糖量成正比。
【器材和 試劑 】
1. 器材 試管及試管架、可見光分光光度計、恒溫水浴箱、微量加樣器、吸量管、吸耳球、光徑 1cm/>比色杯、記號筆。
2. 試劑
（1）11mmol/L的酚試劑。
（2）二合酶：主要成分為葡萄糖氧化酶（GOD 380U/ml）與過氧化物酶(POD 300U/ml)。
（3）葡萄糖標準液(100mg/dL)。
（4）磷酸緩沖液：pH7.0 ,100mmol/L。
【操作步驟】
1. 將1ml二合酶加入磷酸緩沖液，制成酶試劑。
2. 將酚試劑與等量酶試劑混合成酶酚混合液。
3. 取10ml 試管 3支，標號，按下表加入溶液：
試管 號
| 空白管
| 標準管
| 測定管
|
血清（ml）
| —
| —
| 0.02
|
葡萄糖標準液(1mg/ml)
| —
| 0.02
| —
|
蒸餾水(ml)
| 0.02
| —
| —
|
酶酚混合液(ml)
| 3.0
| 3.0
| 3.0
|
4. 將各管分別混勻，置 37℃/> 水浴 中保溫10min，然后冷至室溫，以空白管校零點，以波長505nm測定標準管和測定管的吸光度值。比色杯光徑 1cm/>。
5. 計算
葡萄糖含量（mmol/L）= (測定管吸光度/標準管吸光度)×100×0.0555
（注：本法對葡萄糖有專一性，不受其它糖及還原性物質干擾，其正常值為4.22～6.11 mmol/L。0.0555為換算系數。）
【注意事項】
1. 酶酚混合液和樣品的用量可根據需要按比例改變，計算公式不變。
2. 緩沖液中含疊氮鈉作穩定劑，不要用嘴吸，避免與皮膚接觸。
3. 酚試劑有毒，切勿吞咽，如果溢出，請用大量水沖洗被污染的部位。
4. 1mL血清吸管，使用完后立即洗凈，以免血清凝固在細管內。
【思考題】
1. 推導比色法定量分析中的公式。
2. 簡要說明 分光光度計 的操作要領。
3. 說明臨床測定血糖為何空腹采血。
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