正常人角膜上皮細胞培養

實驗材料：

1. 正常人角膜移植供體角膜

2. 胰蛋白酶/EDTA液：0.05%胰蛋白酶，0.5mmol/L EDTA

3. KGM：無血清角質形成細胞培養液，添加0.15mmol/L 鈣、0.1ng/ml 人上皮生長因子、5mg/ml 胰島素、0.5mg/ml 氫化可的松和30mg/ml 牛垂體提取物；MEM；PBSA；胎牛血清

4. FNC：10mg/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和100mg/ml BSA（bovine serum albumin）。BSA作為穩定劑

5. 6孔培養板：用鼠尾Ⅰ型膠原蛋白涂培養板底壁

6. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4

7. 手術刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

8. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1. 將供體角膜放于消毒過的容器上，上皮面朝上，用手術刀切成12個三角形組織片。應一刀切下，避免鋸割。如此仔細處理角膜可減少對膠原基質的破壞和成纖維細胞的脫落。

2. 將角膜組織片的上皮面朝向下，放入用鼠尾Ⅰ型膠原蛋白預處理的6孔培養板，每孔放4個組織塊。

3. 用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養皿表面充分接觸。將組織片放置20min，使其變干。

4. 將一滴KGM輕輕滴于組織片上，在37℃和5%CO2 條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用抗菌素的培養液保存的，但全部操作應在無菌條件下進行。

5. 第2d，在培養皿中加入1ml培養液。在培養早期，可觀察到細胞僅從角膜緣處遷出，但沒有細胞從角膜或虹膜遷出。無血清培養液含有低濃度鈣離子（0.15mmol/L），減少膠原基質降解，故這種培養液可減少成纖維細胞長出。

6. 在植入角膜組織片后第5d，用鑷子將組織片取出，再加入3ml培養液。取出組織片后，貼壁細胞繼續增值。第2周，細胞生長形成單層，呈現上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個角膜約獲得6×106 個上皮細胞。每周換液2次。

7. 擴增培養：取出組織片后，當細胞融合達70%-80%時，用PBS浸洗細胞。然后，在37℃條件下用胰蛋白酶-EDTA液處理4min。用含有10%FBS的PBS終止消化。將細胞離心后，用KGM混懸。計數細胞，以1×104個/cm2密度將細胞接種于涂有FNC的培養皿。在37℃、5%CO2 條件下培養。1d后換培養液。

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