小鼠腦微血管內皮細胞的體外培養
摘要: 目的 探討腦微血管內皮細胞的體外培養方法并進行細胞超微結構研究及組織型纖溶酶原激活物(TPA ) 活性測定。 方法 取新生小鼠腦組織, 通過勻漿、過篩、膠原酶消化、差速粘附等技術對鼠腦微血管內皮細胞進行原代培養, 待細胞鋪滿瓶底時, 用01125%胰酶20102%EDTA 消化, 離心收集內皮細胞, 進行傳代培養。原代、傳代各取8 例, 吸取培養液用酶聯免疫吸附試驗測試TPA 活性。 結果 經D 因子相關抗原免疫組織化學鑒定、細胞超微結構觀察, 證明培養的是血管內皮細胞。培養的腦微血管內皮細胞能合成分泌TPA。 結論 鼠腦微血管內皮細胞的培養為體外研究腦血管疾病提供了可靠的手段。
關鍵詞: 微血管內皮細胞; 細胞培養; 超微結構; 組織型纖溶酶原激活物; 小鼠
通常認為, 腦微血管內皮細胞主要參與構成血腦屏障保護腦。近年來研究表明, 內皮細胞不僅是屏障和半透膜, 還是重要的代謝和內分泌器官。它可以合成、釋放血管緊張素(ACE)、白細胞介素( IL 21、IL 22、IL 23)、五羥色胺(52HT )、組織型纖溶酶原激活物(TPA ) 等多種因子。血管內皮是人體最大的內分泌腺, 幾乎所有的器官組織都受其調節和影響[ 1 ]。因此, 體外內皮細胞的培養、超微結構的觀察及生物活性的測定, 能為腦血管疾病的進一步研究積累資料。
1.材料與方法
參照已有的腦微血管內皮細胞培養方法[ 2～ 4 ] ,進行細胞培養。以直接取自生物體細胞、組織和器官開始的培養稱為原代培養; 不論是否稀釋, 當原代細胞鋪滿瓶底時, 將細胞從一個培養瓶轉移或移植到另一個培養瓶即稱為傳代或傳代培養[ 5 ]。
1.1 原代培養 新生小鼠(福建醫科大學實驗動物中心普通級昆明種小鼠) 無菌條件下取腦, 置于4℃D2Hank’s 液中, 體視顯微鏡下剔除腦膜, 腦組織放入盛有適量D2Hank’s 液的玻璃勻漿器中上下勻漿10 次。經孔徑88 Lm (220 目) 的尼龍網過濾勻漿懸液, 洗滌、離心(1200 r×10 m in) 收集濾網上面的微血管段, 用011% I 型膠原酶于37℃水浴中消化30m in, 吸管吹打。離心(1200 r×10 m in) , 棄上清后加D2Hank’s 液再離心, 重復一次。收集沉淀, 用含15% 新生牛血清的DM EM 培養液(Hepes 20mmo l?L , EDGF 10 Ll?m l, 青霉素100 U ?m l, 鏈霉素100 U ?m l) 懸浮接種于多聚賴氨酸覆蓋的培養瓶中, 37℃、5%CO 2 的培養箱(美國Fo rm a 公司) 中孵育, 4 h 后換全液, 以后每2 天換液一次, 并用刮除法去除非內皮細胞, 至細胞鋪滿瓶底。培養過程中,細胞標本用SP 試劑盒進行D 因子相關抗原(福州邁新公司) 的鑒定。離心包埋法制備電鏡標本, HU 212A 透射電鏡下觀察、攝影。
1.2 傳代培養 待細胞出現“鋪路石”征象, 棄培養液, 用01125% 胰酶20102%EDTA 消化, 并在倒置相差顯微鏡下觀察, 當發現細胞回縮、細胞間隙增大后, 立即加血清終止消化, 離心收集內皮細胞, 以1∶2比例稀釋接種于培養瓶中, 以后每兩天換液一次至細胞鋪滿瓶底。
1.3 生化指標 原代、傳代培養每組各取8 例, 待 細胞鋪滿瓶底時, 吸取培養液用酶聯免疫吸附試驗測試TPA 活性(TPA 試劑盒購自上海醫科大學分子遺傳研究室)。
2.結 果
倒置相差顯微鏡下觀察經勻漿、過濾分離出的腦微血管段, 可見其呈單枝或分枝狀, 內皮細胞核清晰(圖1)。經酶處理后的微血管段, 接種1 h 后細胞開始貼壁, 最初細胞形態呈單一的球形, 培養5～ 7天后, 細胞呈長梭形, 至第12 天, 細胞鋪展開來, 形成致密的單層細胞, 呈“鋪路石”征象(圖2)。生長成片后的培養內皮細胞沒有向多層生長的傾向, 也沒有邊緣的重疊。透射電鏡下觀察(圖3, 4) , 可見細胞胞質內質網、高爾基復合體發達, 游離核糖體、線粒體及吞飲小泡豐富, 胞質中存在大量走向一致的微絲, 尤以周圍部明顯。雙層核膜清晰可見, 未見W eibel2Palade 小體。相鄰內皮細胞間有緊密連接。原代細胞進行D 因子相關抗原免疫組織化學檢查,可見細胞漿被染成土黃色(圖5) , 證實培養的細胞為血管內皮細胞。原代培養內皮細胞TPA 活性為(191440±11728) ×10- 2 IU ?m l, 傳代培養內皮細胞TPA 活性為(161450±01562) ×10- 2 IU ?m l。
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