HUVEC分離培養

溶液以及器材：

1、用RPMI-1640配I型膠原酶 0.1g/100ml

2、配三抗：

青霉素：100ku/L

鏈霉素：100ku/L

慶大霉素：100ku/L

3、培養液（M199＋ECGS[3ug/ml]＋15％胎牛血清）有EGF可以適當加點10ng/ml

4、大瓶生理鹽水

5、廣口瓶（臍帶數＋1）

6、止血鉗（臍帶數×2＋2）

7、大針頭數個（用于吸取生理鹽水，膠原酶）

8、手術剪刀數把

使用前器械高溫蒸氣滅菌。

實驗步驟：

1、去婦產科取當天新鮮臍帶（廣口瓶；生理鹽水），試驗前放入4度冰箱。

2、辨別臍帶靜脈（粗大的那根），順著靜脈瓣插入大針頭，注入生理鹽水，充分沖洗臍靜脈，至流出液體中無可見血液。

3、夾住臍帶下端，從上端灌注0.1%的膠原酶，鉗住臍靜脈上端，37度孵育15分鐘（已經足夠）；如果消化液中出現絮狀物，說明消化時間過長。

4、收集消化液，并用含小牛血清的RPMI-1640 沖洗臍靜脈，沖洗液并入消化液中。1000－1500轉離心10分鐘。

5、將細胞懸浮于培養液中（一根臍帶一般可以一個培養瓶，如果細胞少就六孔板一個孔），細胞不能太稀疏，否則生長緩慢。

6、正常情況下三天長滿傳代，正常的內皮細胞長滿后如同卵石狀。

7、使用前運用標記因子CD31或VIII因子對內皮細胞進行鑒定。

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