大鼠主動脈內皮細胞的培養

材料與方法：

材料 :

培養皿、培養瓶、燒瓶、試管，玻璃針等。

眼科剪、眼科鑷、手術刀片。

5%CO2孵箱、PH計。

恒溫水浴箱。

PMi1640培養基，D-Hank’s緩沖液 、胎牛血清，內皮生長因子（ECGF），青霉素，鏈霉素,戊巴比妥鈉等。

方法：

1、取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大劑量2%戊巴比妥鈉麻醉處死，將處死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超凈臺。在無菌狀態下剪開胸腹腔，分離胸主動脈,用2ｍｌ注射器從主動脈弓處向胸主動脈注入D-Hank’s液,驅除殘血,取主動脈弓至腎動脈一段，兩端結扎剪斷，放入60℃預熱無菌水中2秒。然后置于準備好的RPMi1640培養基（含雙抗）中。

2、剪切：在超凈臺上，將血管置于培養皿中,用眼科鑷小心剝離外膜面的結締組織,并從根部剪去所有肋間動脈。無血清培養基沖洗數遍,去除殘血后,將動脈轉移至另一含少量培基的無菌培養皿中，用刀片將主動脈兩末端切去,剩下的主動脈切成寬1～1.5ｍｍ的環。

3、接種：將動脈環豎直放入35ｍｍ培養皿(1%明膠4℃預置過夜,用前2ｈ移入ＣＯ2培養箱,用前培養液沖洗)中。置ＣＯ2培養箱2ｈ后,加入1.5ｍl培養基。放入37℃,5%ＣＯ2培養箱中培養。72ｈ后細胞從環內外生長遷出,環內為內皮細胞,環外為成纖維細胞。將動脈環除去后,可看到內膜面細胞集落與外膜面之間有明顯的無細胞區界限，用玻璃針剔除成纖維細胞,得到純的內皮細胞生長克隆。繼續培養10～15ｄ，此時FBS濃度為２０％,形成細胞單層。

4、置于5%CO2孵箱中培養，每隔3天換液，培養時添加15% FBS，5～10μg/ml的內皮細胞生長因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待細胞90%~95%融合時，0.25胰蛋白酶消化傳代。

5、內皮細胞鑒定：相差顯微鏡下,細胞呈單層鋪路石狀;免疫組化證明有vWF相關抗原存在。

6、注意事項:將分離出來的主動脈熱處理時溫度以60℃2秒為宜,太低則成纖維細胞多,太高或時間久則內皮細胞遷出減少。

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