大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

【摘　要】目的：培養(yǎng)腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞。方法：取1～5d Wistar乳鼠腦皮質(zhì),經(jīng)不同孔徑的篩網(wǎng)過濾后，用膠原酶振蕩消化獲得的微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，7～9d呈典型的鋪路卵石樣征象。結(jié)論：建立了一種簡(jiǎn)便易行的培養(yǎng)腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞培養(yǎng)；微血管內(nèi)皮細(xì)胞；Wistar大鼠

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)能，在許多病理狀態(tài)下起重要作用[1]。建立腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)，可獲得大量比較單純的內(nèi)皮細(xì)胞，為研究血腦屏障和腦血管疾病以及新藥篩選提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１疚膱?bào)告大鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的一種方法。

1.材料與方法

1.1 鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

1.1.1 鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離　　取10～12只1～5d的Wistar大鼠（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄兼用，于超凈工作臺(tái)上操作者左手拇食二指持乳鼠頸部稍下處，常規(guī)消毒頭皮后，右手持眼科剪沿正中線剪開頭皮與顱骨，用眼科彎鑷取出鼠腦。取出的腦立即放入盛有冰冷Hank's液的平皿中。去除大血管、軟腦膜、腦干、小腦和大腦髓質(zhì)。將收集到的大腦皮質(zhì)，轉(zhuǎn)入另一先放有170μm不銹鋼篩網(wǎng)的冰冷Hank's液的平皿中，用玻璃吸管反復(fù)吹打呈腦勻漿，棄濾液，再用Hank's液反復(fù)沖洗網(wǎng)上的血管，將收集的血管段液再經(jīng)孔徑75μm尼龍網(wǎng)過濾，500轉(zhuǎn)離心3min，棄上清，收集沉淀的血管段。

1.1.2　原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)　將　微血管段移入0.1‰的Ⅶ膠原酶中37℃振蕩消化20min，800r/min離心3min，棄上清，沉淀物加入含15%胎牛血清的M199（完全培養(yǎng)液）制成細(xì)胞懸液，接種于35ml 塑料培養(yǎng)瓶(Nunclon)中（瓶底朝上），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，2h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（瓶底朝下），1d后換全液，以剔除混雜的非內(nèi)皮細(xì)胞，以后每3d換完全培養(yǎng)液1次進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。

1.1.3　細(xì)胞傳代培養(yǎng)　細(xì)胞原代培養(yǎng)7～9d后，細(xì)胞呈單層密集生長(zhǎng)近亞融合時(shí)進(jìn)行傳代繁殖，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化細(xì)胞，見細(xì)胞大部分脫落時(shí)加入完全培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打,制成細(xì)胞懸液,按實(shí)驗(yàn)需要傳代,傳代時(shí)接種密度為3×104 /ml。

1.2　特性鑒定

1.2.1 　形態(tài)學(xué)　用Olympus倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)規(guī)律。

1.2.2　用MTT法測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)率　　傳代培養(yǎng)至第3代，接種于24孔培養(yǎng)板中，接種密度為3×104/ml，在1～11d 內(nèi)，每天收集3孔的細(xì)胞進(jìn)行MTT法測(cè)細(xì)胞的活力。即細(xì)胞培養(yǎng)至所選時(shí)間，棄上清，每孔加入400μl M199，40μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心2000轉(zhuǎn)，5min，棄上清，每孔加入400μl二甲基亞砜溶解紫色結(jié)晶，再轉(zhuǎn)入96孔板，于自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定OD570 值，吸光度值的大小反映內(nèi)皮細(xì)胞成活數(shù)量及活性。

1.2.3 　免疫組化　將長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片取出，用濃度為0.1 mmol/L PBS漂洗后，4℃丙酮固定10min，滴加Ⅷ因子相關(guān)抗原的抗體(博士德，即用型)，再按通用型SP kit (北京中山)說明進(jìn)行操作，DAB顯色，封片后鏡下觀察和照相。

2.結(jié)　果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡觀察分離的微血管段形態(tài)各異，長(zhǎng)短不等，呈單枝或多枝狀。經(jīng)膠原酶消化后，微血管管壁不清，壁上內(nèi)皮細(xì)胞清晰可見。2h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，目的是去除首先貼壁的長(zhǎng)梭形成纖維細(xì)胞。混懸液內(nèi)還有未分離干凈的神經(jīng)組織碎片和紅細(xì)胞，1d后換全液即可清除，換液后可見大部分微血管片段已貼壁，邊緣長(zhǎng)出單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，呈三角形或長(zhǎng)梭形，排列不規(guī)則，核淡，胞膜明顯，2～3d可見細(xì)胞分裂增殖形成散在細(xì)胞群落，7～9d融合成片狀，細(xì)胞緊密排列，互不重疊，呈典型的鋪路卵石樣結(jié)構(gòu)(見圖1)。傳代細(xì)胞初種時(shí)為明亮的園球形，懸浮于培養(yǎng)液中，4h后大部分細(xì)胞貼壁，呈扁平狀，24h后細(xì)胞胞體變大，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞多呈三角形或長(zhǎng)梭形，7d后細(xì)胞增殖成單層片狀。傳至第4代時(shí)細(xì)胞輪廓欠清。測(cè)定第三代內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)率表明內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)高峰在7～9d 以后不再增殖，出現(xiàn)生長(zhǎng)接觸抑制現(xiàn)象。

2.2 免疫組化

原代、第三代內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行ⅧF：Ag免疫組化檢查，95%以上細(xì)胞的胞漿和核膜周圍被染成棕褐色，證實(shí)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞。

3.討　論

血管內(nèi)皮遍布全身，位于整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)的內(nèi)表面，它不僅是血管的被動(dòng)襯里，而且是肌體最大的內(nèi)分泌腺[2]。由于它所處的特殊位置，可通過不同的機(jī)制和生化信息，來釋放血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、血液流動(dòng)性、凝血過程、血管床張力及通透性，參與正常和新生組織的血管形成。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于毛細(xì)血管微循環(huán)的一種特殊細(xì)胞，具有極其重要的功能。它是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，同時(shí)與腦水腫、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展、腦腫瘤的浸潤和擴(kuò)散，尤其是腦腫瘤的血管形成等病理過程緊密相關(guān)。我們對(duì)鼠腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的償試，為體外研究各種顱腦疾病提供一種嶄新的實(shí)驗(yàn)工具。由于不同來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在較大的差異性，人們常根據(jù)不同的研究目的選取不同的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

國外對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)始于70年代末，難點(diǎn)主要在于腦微血管分離步驟繁雜、內(nèi)皮細(xì)胞難以純化，建立與維持微血管內(nèi)皮細(xì)胞很難，且有些方法不適合于國內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)室，如需要高速冷凍離心機(jī)和價(jià)格昂貴的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等 [3]，故國內(nèi)關(guān)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的報(bào)道較少。我們根據(jù)本校條件，探討了培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，成功進(jìn)行了Wistar 乳鼠大腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

根據(jù)我們的體會(huì)，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

(1)仔細(xì)剝離軟腦膜，去除腦干、大血管、小腦和大腦髓質(zhì)后，吹打成勻漿的腦組織經(jīng)過 170μm和75μm兩種孔徑濾網(wǎng)過濾，這樣既可去除較大組織塊和大血管，又可達(dá)到收集微血管段的目的，因據(jù)Brendel等[4]研究發(fā)現(xiàn)鼠腦微血管的直徑在6～80μm之間，分離腦微血管多選直徑80μm左右的濾網(wǎng)篩選。

(2)膠原酶充分消化。我們用0.1‰的Ⅶ膠原酶在37℃恒溫?fù)u床振蕩消化20min即可。酶充分消化有助于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、去除周皮細(xì)胞。消化時(shí)間的長(zhǎng)短因膠原酶的類型與不同的濃度而有所不同。

(3)原代培養(yǎng)時(shí)需收集到足夠量的微血管，否則培養(yǎng)難以成功。

(4) 原代培養(yǎng)2h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶以去除先貼壁的成纖維細(xì)胞，24h后換液一次以去除未貼壁的雜質(zhì)，凈化培養(yǎng)環(huán)境。開始培養(yǎng)的2～5d，在倒置顯微鏡下用機(jī)械方法(細(xì)胞刮刀)刮去可疑的細(xì)胞或細(xì)胞群落。

(5)傳代培養(yǎng)時(shí)，只收集最先脫落的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，這是因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞具有貼壁早，而在酶消化時(shí)易脫落的特性[5]。

(6)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞最好選用含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)液來培養(yǎng)，這樣有利于內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、逐漸淘汰混雜的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。

參　考　文　獻(xiàn)　

[1] Chi OZ, Wei NM, Sinha AK, et al. Effects of inhibition of nitric oxide synthase on blood-brain barrier transport in focal cerebral ischemia[J]. Pharmacology,1994;48:367-373.

[2] Inagami T, Naruse M, Richard H. Endothelium as an endocrine organ[J]. Annu Rev Physiol,1995;57:171-189.

[3] Gordon EL, Danielsson PE, Hguyen TS, et al. A comparision of primary cultures of rat cerebral microvascular endothelial cells to rat aortic endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol,1991;27A:312-326.

[4] Brendel K, Meezan E, Carlson EC. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex[J]. Science, 1974;185:953-955.

[5] Browman PD, Betz AL, Diane AR,et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain[J]. In Vitro,1981;17(4):253-262.

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