兔膀胱平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

一、摘要

目的：建立兔膀胱平滑肌細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定的方法。方法：成年新西蘭白兔兩只（正常及梗阻各一只），采用酶法分離技術獲得膀胱平滑肌細胞后于10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)和擴增情況，用爬片染色、電鏡、蛋白質α-肌動蛋白（α-actin）鑒定細胞類型。結果：倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構、細胞爬片HE染色及電鏡檢查均證實為平滑肌細胞。免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應。從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎99%。結論：該方法易行、可靠、在短期內可獲得大量高純度膀胱平滑肌細胞。

二、材料及方法

1、試劑及標本

成同齡雄性新西蘭白兔2只，體重約2.5~3k(購于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實驗中心)，一只為正常成年雄性新西蘭白兔，一只為膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西蘭白兔。DMEM、Ⅱ型膠原酶及α-肌動蛋白抗體（α-actin）購于北京華美公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；胰蛋白酶購于南京生興公司。

2、 膀胱平滑肌細胞酶法分離

肌注鹽酸氯胺酮200mg及氟哌利多5mg麻醉，待兔進入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。超凈臺內依次慶大霉素溶液（濃度為100單位/毫升）、生理鹽水及D-Hanks液中浸泡洗滌5分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。肌肉剪成肉糜后0.1%膠原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40過夜消化（約10-12小時）。然后加0.25%胰蛋白酶370消化30分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。用100目細胞篩過濾該絮狀液，混懸液離心（1000轉/分，離心半徑13cm）5分鐘，沉淀的細胞移入培養(yǎng)皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2、370飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液每周更換2-3次。

3、傳代培養(yǎng)

待培養(yǎng)的細胞通過增殖達到約80%匯合狀態(tài)時做傳代處理。棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入適量的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之。加入適量的消化液，使其覆蓋整個細胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱，不時在倒置顯微鏡下觀察，當細胞胞質回縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁制備細胞懸液，吹打時不能用力過猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細胞。細胞進行計數后，按照1X105~106密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶中。

4、培養(yǎng)細胞的觀察及鑒定

采用倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞的形態(tài)及生長情況。細胞爬片HE染色觀察細胞形態(tài)。電鏡檢查。免疫組化染色檢測α-actin。

結果

兩只兔所有標本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細胞24小時均可見膀胱平滑肌細胞貼壁生長，正常兔7天左右、而梗阻兔則需10~12天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培養(yǎng)瓶約80%匯合。本組中均傳至第8代，經第8次傳代后，平滑肌細胞仍生長迅速，未見衰老跡象。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結構（圖1 對照組2周的細胞；圖2 實驗組培養(yǎng)2周的細胞）。細胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細胞細胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細胞核型。電鏡檢查可見平滑肌細胞密班結構。免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應。從細胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-actin呈陽性反應中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細胞的純度幾乎99%。

圖1 對照組2周的細胞

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