原代細胞培養技術

一、組織塊直接培養法

1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。

2、用手術剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊，再用Hank's液洗三次。

3、將組織塊轉移至培養瓶，并貼附于瓶底面。

4、輕輕將培養瓶翻轉，瓶底朝上，向瓶內注入適量的培養液，將培養瓶放置在37℃恒溫箱內培養。

5、放置待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），37℃繼續培養。

二、消化培養法

1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。

2、用手術剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊，再用Hank's液洗三次。

3、視組織塊量加入酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。

4、加入3—5ml培養液以終止酶消化作用（或加入相關酶抑制劑）。

5、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

6、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。

7、加入Hank's液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。

8、加入培養液1—2ml（視細胞量），血球計數板計數。

9、將細胞轉移到培養瓶中，37℃下培養。

三、 器官培養

1、將不銹網做成支架形狀，調整其高度至培養皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。

2、將培養液加入培養皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。

3、將要培養器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過200μm，水平面積不超過10mm2 。

4、將上述準備好的培養物放入CO2 培養箱，并加注氧氣調整氧分壓，最好到90%。

5、培養過程中要注意觀察培養液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。

6、上述可進行器官培養1-3周，每2-3天換液一次，并根據情況做進一步實驗和檢測。

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