正常動物胸腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 胸腺上皮細(xì)胞來源；一般取材小鼠或手術(shù)切取的兒童之胸腺；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 有血清培養(yǎng)液：可使用RPMI1640培養(yǎng)液，添加10%胎牛血清、谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸鈉1mmol/L、非必需氨基酸1mmol/L、2-巰基乙醇（2-ME）5×10-5 mol/L、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml（Schreiber et al.1991）。也可以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

4. 化學(xué)限定性培養(yǎng)液：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM，添加HDL100μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白50μg/ml、胰島素5μg/ml、氫化可的松2.7×10-7 mol/L、EGF 10ng/ml、硒25 ng/ml以及三碘甲腺原氨酸（T3 ）1×10-10mol/L（Schreiber et al.1991）；

5. 消化液：原代培養(yǎng)時，從胸腺組織制備細(xì)胞懸液時，所用的消化液為1mg/ml的膠原酶，用含有15%胎牛血清的DMEM配制。傳代時所用的消化液為0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶混合液；

6. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗，無菌消毒手術(shù)器械；

7. 離心管（15ml、50ml）

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 若取材于小鼠，先將動物處死，用75%乙醇消毒。打開胸腔，取出胸腺。如果取材于手術(shù)切除的兒童胸腺，將所取胸腺組織置于含抗生素的平衡鹽溶液中；

2. 將切取的胸腺組織盡可能去除表面的結(jié)締組織被膜。將胸腺實(shí)質(zhì)剪成約1mm3 大小的植塊；

3. 用平衡鹽溶液反復(fù)洗滌植塊，以盡量洗去胸腺細(xì)胞；

4. 在37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中，用膠原酶消化液消化約1.5h；

5. 在膠原酶消化液中，將組織塊進(jìn)一步剪碎；

6. 靜置，待組織塊下沉，棄去上清液。將組織塊重新懸浮于無血清培養(yǎng)液中；

7. 重復(fù)步驟5可達(dá)3次；

8. 將植塊接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)器皿可以用生長基質(zhì)物質(zhì)預(yù)先包被。在原代培養(yǎng)最初6d內(nèi)，不更換培養(yǎng)液；

注意事項：

胸腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)最大的問題是成纖維細(xì)胞的過度生長，故抑制成纖維細(xì)胞的生長是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的成功的關(guān)鍵。

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