從單個核細胞中分離T細胞
一、用玫瑰花結形成試驗分離E＋細胞
1．制備AET-綿羊紅細胞
1）在刻度離心管中，用無菌的含5％小牛血清的Hanks液洗滌綿羊紅細胞3次，每次離心500×g 10分鐘。
2）吸凈上清液，測量紅細胞比容。輕擊試管分散紅細胞，加入4倍紅細胞比容量、新鮮制備的AET溶液，混勻。室溫中反應30分鐘。
3）用無菌的含5％小牛血清的Hanks液洗滌AET-綿羊紅細胞5次，每次離心500×g，10分鐘。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞懸浮至10％（v/v）濃度。10％ AET-綿羊紅細胞懸液可在4℃保存三周。
2．用玫瑰花結形成試驗分離E＋細胞（Ficoll分離法）
1）用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液將單個核細胞懸浮至107/ml，加入1/10~1/20量的10％ AET-綿羊紅細胞懸液?；旌虾螅覝胤胖?小時。離心500×g 10分鐘，4℃過夜。
2）吸去上清液，用手輕輕旋轉離心管，使細胞懸浮，不要用吸管吹打。加入同樣培養液至原容量。
3）將細胞懸液小心加在半量淋巴細胞分離液上，室溫中水平離心500×g 20分鐘。
4）吸棄上層無細胞液體，將細胞培養液和淋巴細胞分離液交界面的細胞和約85％的淋巴細胞分離液吸出，置另一離心管中。交界面的即E－細胞，立即向該細胞懸液中加等量洗滌液，離心500×g 10分鐘，去上清液；再用洗滌液同樣洗滌2次，除去淋巴細胞分離液，以備進一步分離B淋巴細胞和單核細胞。
5）分離E＋細胞：吸出剩余液體，用10倍量Gey’s液懸浮沉淀細胞1～2分鐘，低滲溶解紅細胞。立即加入同量兩倍濃縮的PBS，恢復等滲。離心500×g 10分鐘，去上清液。再用RPMI-1640培養液同樣洗滌2次。此即E＋細胞。用1％臺盼藍染色法測定細胞濃度和細胞活力，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞懸浮至適當濃度。
3．用玫瑰花結形成試驗分離E＋細胞（Percoll分離法）
制備Percoll密度梯度
1）將1份10倍濃縮的PBS與9份Percoll混合，得到等滲的Percoll溶液，比重應是1.127。
2）稀釋液（含25mmol/L Hepes, 10%小牛血清的RPMI-1640培養液）的比重約1.008左右。按下式配制不同比重的Percoll溶液： ％ Percoll＝（所需比重－稀釋液比重）/（等滲Percoll溶液比重－稀釋液比重）×100
分離E＋細胞
1）取10ml 5×106/ml的單個核細胞置離心管中，加2.5ml 10％ AET-綿羊紅細胞和1ml小牛血清，混合后，20℃離心200×g 15分鐘，確定沒有懸浮的紅細胞，冰浴60分鐘或過夜。
2）輕輕旋轉離心管，使細胞懸浮。注意不要用吸管吹打，吹打會打散一些玫瑰花結。將細胞懸液小心加在7～8ml Percoll溶液上，室溫中水平離心500×g 20分鐘。
3）吸棄上層無細胞液體，將交界面的細胞和約85％的Percoll溶液吸出，置另一離心管中。此即E－細胞，應立即用RPMI-1640培養液洗去Percoll。
4）收集E＋細胞：盡量吸棄紅細胞上的Percoll溶液，用5ml Gey’s液懸浮細胞1～2分鐘，溶解紅細胞。立即將加入同量兩倍濃縮的PBS，恢復等滲，離心500×g 10分鐘，去上清液。再用RPMI-1640培養液同樣洗滌2此。
5）分別用RPMI-1640培養液懸浮E＋和E－細胞，計數細胞。用熒光標記的抗體測定制劑中的B細胞、T細胞和單核細胞百分比。
二、用尼龍毛分析T細胞
尼龍毛柱的制備（注意無菌操作）
1.取直徑3D，長度約10cm的尼龍毛，用0.2mol/L HCl浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈HCl，置37℃烘干備用。
2.稱取50mg尼龍毛，均勻分散后置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約5～6cm。此柱可分離約2×107細胞。將柱置－20℃可保存2～3個月。
分離細胞
1.取PBMC，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞配成2×107/0.5ml。
2.融化凍存的尼龍毛柱，以每分鐘5～7滴的速度放出Hanks液。用5ml預溫至37℃的細胞培養液洗滌尼龍毛柱。將0.5ml上述PBMC懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細胞培養液，夾住塑料管。
3.在37℃ 5％ CO2飽和水汽二氧化碳培養箱中培養1小時，使細胞與尼龍毛充分粘附。用5ml預溫至37℃的細胞培養液洗脫尼龍毛柱。洗脫液中含有純的T細胞。1000×g離心洗脫液10分鐘，去上清液。再用細胞培養液洗滌細胞1次。計數細胞，用細胞培養液將細胞配成適當濃度。
三、用免疫磁珠法分離T細胞
將特異性抗T細胞單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic beads），用這種免疫磁珠從PBMC中結合T細胞。在磁場中，結合T細胞的免疫磁珠固定了，未結合的B細胞和其它細胞被洗脫下來。再從免疫磁珠上洗脫T細胞。
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