新型核酸衍生體2-Cl-C.OXT-A在血管新生中的作用
香川大學醫學部 藥物生物體情報學講座 塚本郁子
前言
血管新生和在舊血管里構造新血管對在胎兒的生長、創傷治愈、腫瘤增殖及轉移等各種過程中有重要作用。特別它是腫瘤生長、轉移的必經階段,一直以來不少科研人員將血管新生的抑制劑用于抗腫瘤藥物的研究。至于血管新生促進劑,它主要是用于治療血流灌注不足等諸多癥狀,但實際應用不多,主要是因為除了從生物體提取的增殖因子以外,科研人員很少能識別出其他有此作用的物質。血管新生治療在血流灌注不足等方面被寄予厚望。血流灌注不足是由于糖尿病患者的慢性閉塞性動脈硬化、脈管炎病及其他動脈硬化等各種血管閉塞等引起的。但是現在進行的血管新生治療只限于向患者注射增殖因子和進行基因治療等方法,眾人期待能研發出可以替代這些方法的穩定、便宜的低分子。本文作者及研究團隊介紹新型低分子化合物2-Cl-C.OXT-A在血管新生方面的作用。
2-Cl-C.OXT-A的活性表達過程
以前此研究團隊以稀少糖為中心進行單糖的生理活性研究。在各種生理活性的報告中,研究團隊研究的是稀少糖對于血管內皮細胞在管腔形成過程中的影響。通過血管內皮細胞形成管腔,是生物體血管新生的模型。這個實驗篩選了超過40種單糖的效果,并確定一部分的稀少糖、核糖、2-脫氧核糖對管腔形成有抑制作用。核糖、2-脫氧核糖不用細說,因為它們是生物體內核酸的組成成分。為此研究人員將研究對象擴大到單糖衍生體的核酸,核酸醫藥品、合成核酸和其衍生體等的活性。研究的核酸達到30多種。與預期相同,多數核酸會抑制管腔形成,但其中只有一種物質顯示了強大的促進作用。那個物質就是本文要介紹的2-Cl-C.OXT-A)。
2-Cl-C.OXT-A簡介
2-Cl-C.OXT-A及其類似化合物的結構式如圖1所示。這是日本德島文理大學香川藥學部的丸山德見教授按照Basacchi及其研究團隊的方法合成出來的。2-Cl-C.OXT-A的2位被氯取代,沒有與核糖、2-脫氧核糖結合,而是結合了有兩個羥甲基的丁烷環的結構。同樣的丁烷環里結合了核酸堿基鳥嘌呤的C.OXT-G(此化合物被開發成抗病毒藥Lobucavir),與現在經常使用的抗病毒藥Ganciclovir有相似的結構。為了討論2-Cl-C.OXT-A活性的相關活性結構,我們比較了圖1里化合物的活性。
圖1、2-Cl-C.OXT-A及其類似化合物的結構式
管腔形成促進與化合物構型相關
把人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)和人類成纖維細胞一同培養,HUVEC會形成管腔。在此基礎上科研人員研究了這一系列添加劑的效果。在培養基里添加1μM、10μM、100μM等不同濃度的2-Cl-C.OXT-A,各濃度下形成的管腔如圖2所示。陽性對照的VEGF(vascular endothelial growth factor A)與2-Cl-C.OXT-A促進管腔形成作用都很明顯,但2-Cl-C.OXT-A作用比VEGF更強,并且這種作用呈濃度依賴性。無添加的對照里形成的管腔面積為1時,2-Cl-C.OXT-A相對值為1μM為1.36±0.40、10μM為2.44±0.89、100μM為3.78±1.09。VEGF值為1.84±0.48(各n=9、mean±SD),說明10μM 的2-Cl-C.OXT-A比VEGF有相同甚至更強的作用,而100μM的2-Cl-C.OXT-A的作用甚至是VEGF的2倍。
這種促進作用在去除了2-Cl-C.OXT-A腺嘌呤部分的堿基,(圖1的C.OXT-A),腺嘌呤變成鳥嘌呤(圖1的C.OXT-G)后消失。2-Cl-腺嘌呤的結構是這個生理活性所必須的。但是,只有2-Cl-腺嘌呤結構是不夠的。圖1所示的2-Cl-腺苷、2-Cl-2'-脫氧腺苷雖然有2-Cl-腺嘌呤結構,卻沒有管腔形成促進活性。證明活性表達,需要含有鹵化的腺嘌呤和有兩個羥甲基的丁烷環這兩個條件。
2-Cl-C.OXT-A的管腔形成促進作用的最高峰值在100μM,超過了這個濃度其作用就會減弱,超過1000μM后會轉為抑制作用。
圖2、2-Cl-C.OXT-A促進HUVEC的管腔形成
對增殖和遷移的影響
生物體內血管新生時,血管內皮細胞形成管腔前后,會發生血管內皮細胞的遷移。例如腫瘤細胞會分泌血管新生誘發因子VEGF,再以此向附近的血管內皮細胞發出血管新生的信號,接收到信號后,血管內皮細胞會構建新的血管。利用HUVEC的增殖和遷移研究2-Cl-C.OXT-A的效果時,發現2-Cl-C.OXT-A在濃度為10-100μM條件下,會促進HUVEC的增殖和遷移。
信號轉導系統的研究
生物體內血管新生的啟動子(Promoter)已知有好幾種,其中最強大的是VEGF。在血管必須存在的地方會分泌VEGF,并與附近的血管內皮細胞里存在的受體結合從而誘導血管新生。關于這過程中信號轉導的研究報告很多,但依然有許多不明之處。研究團隊使用經典的通路之一的MAP kinase cascade相關的磷酸化抗體來研究2-Cl-C.OXT-A的效果。圖3所示,添加了2-Cl-C.OXT-A后10-15分鐘,促進HUVEC的MAP kINASEerk1/2的磷酸化,同時下游的MAP kinasekinase MEK的磷酸化也增加。MEK inhibitor PD98059不但會抑制ERK1/2的磷酸化,還會抑制HUVEC的管腔形成。然而由于2-Cl-C.OXT-A的促進管腔形成作用,它能激活MEK相關的信號轉導系統。另外,在最上游里添加VEGF受體的抑制劑SU5416,對2-Cl-C.OXT-A活化ERK1/2沒有影響,因此2-Cl-C.OXT-A的作用點在其下游和MEK之間。
圖3、在HUVEC中2-Cl-C.OXT-A對MEK、ERK1/2的活性化
活體內實驗
用活體內實驗證明2-Cl-C.OXT-A的血管新生作用,在活體內用雞胚尿囊絨膜和兔角膜研究。
圖4是用雞胚尿囊絨膜的實驗(CAM assay)結果。是在孵化第11日的胚絨尿膜里添加添加劑,放置于20μl的Matrigel里,再培養42-48小時后的胚絨尿膜樣子。添加了VEGF、2-Cl-C.OXT-A的凝膠有血管新生,且能使附近的血管更加靠近,而在無添加的凝膠里沒有新生血管的形成。
兔角膜的實驗方法(corneal micropocket assay)是在一邊眼角膜里制作的口袋,埋入含有添加劑的Φ3mm X厚度0.5mm的EVA(Ethylene vinyl acetate copolymer)薄膜,7天后再觀察。并在對眼里埋入無添加的薄膜作對照。陽性對照使用bFGF(basic fibroblast growth factor)。結果按照向薄膜延伸的新生血管的總長度來評價,無添加對照長度為1.62±0.85mm、bFGF為6.96±1.18mm,然后2-Cl-C.OXT-A為5.72±0.46mm(各自n=5、mean±SE),2-Cl-C.OXT-A與bFGF陽性對照結論相同,證明2-Cl-C.OXT-A能增加血管新生。
圖4、CAM(chorioallantoic membrane) assay里2-Cl-C.OXT-A的促進作用。圖為在Matrigel 20μl中的添加劑。
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